一種真菌來源的酸性纖維素酶及其基因和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及基因工程領(lǐng)域。具體地，本發(fā)明設(shè)及一種來源于真菌的酸性纖維素酶 及其基因和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素及木質(zhì)素等物質(zhì)構(gòu)成。纖維素是一種重要的 多糖，它是植物細(xì)胞支撐物質(zhì)的材料，是自然界最豐富的生物質(zhì)資源，纖維素的結(jié)構(gòu)確定 為P-D-葡萄糖單元經(jīng)0 - (1 - 4)糖巧鍵連接而成的直鏈多聚體，結(jié)構(gòu)中沒有分支，其 能夠被纖維素酶降解為葡萄糖。
[0003] 纖維素酶是指能夠水解葡萄糖巧鍵，將纖維素分解成纖維二糖和葡萄糖的一組酶 的總稱。其對(duì)纖維素的水解過程主要包括=步：第一步是內(nèi)切型纖維素酶作用于纖維素內(nèi) 部的無定形區(qū)，隨即水解0 - (1-4)糖巧鍵將纖維素分子截短，隨后外切型纖維素酶，作 用于纖維素線狀分子末端，水解P- (1-4)糖巧鍵，每次切下一個(gè)纖維二糖分子，最后， 葡萄糖巧酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。
[0004] 近年來，隨著綠色飼料的興起W及人們環(huán)保意識(shí)的增強(qiáng)，能源的再生利用研究，人 們對(duì)纖維素酶的研究和利用已進(jìn)入了一個(gè)新的階段。纖維素酶已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、 飼料、造紙、紡織印染、石油開采、精細(xì)化工及生物技術(shù)等諸多領(lǐng)域，是一種新型的工業(yè)酶， 具有很大的潛在應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 纖維素酶廣泛存在于細(xì)菌、放線菌、真菌、植物、動(dòng)物等生物中。不同的微生物產(chǎn)生 的纖維素酶，其結(jié)構(gòu)和功能差異較大，纖維素酶按作用的最適抑不同可分為：酸性纖維素 酶（最適抑約為4.8)，它是目前研究較多和應(yīng)用最廣泛的纖維素酶，主要由康氏木霉，里氏 木霉，綠色木霉，黑曲霉，青霉等產(chǎn)生；中性纖維素酶（最適P冊(cè)-8,），主要由長梗木霉，腐殖 菌，芽抱桿菌等產(chǎn)生；堿性纖維素酶（最適P冊(cè)-11)，主要由嗜熱芽抱桿菌，腐殖菌等產(chǎn)生。 自然界中存在的纖維素資源來源復(fù)雜，其結(jié)構(gòu)和功能差異較大，不同來源的纖維素酶對(duì)它 們的降解效果也不盡相同，針對(duì)不同來源的纖維素尋找降解效果較高的纖維素酶，是當(dāng)前 纖維素酶領(lǐng)域的熱點(diǎn)之一。目前國內(nèi)外，雖然許多纖維素酶被克隆分離及性質(zhì)測(cè)定，但運(yùn)些 酶的性質(zhì)特征，均存在一些缺陷，例如，抑作用范圍不合適，熱穩(wěn)定性差，表達(dá)量低等，均不 能滿足實(shí)際應(yīng)用的需要。因此人們希望能夠找到新的能夠滿足實(shí)際應(yīng)用需求的纖維素酶， 從而能夠進(jìn)一步推廣纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用。
[0006] 本發(fā)明從ProstheciumopalusCBS125034菌株中得到了一個(gè)新的纖維素酶基 因，其編碼的纖維素酶具有W下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)：酸性、廣泛的底物特異性、容易發(fā)酵生產(chǎn)。所有運(yùn) 些優(yōu)點(diǎn)都意味著新發(fā)明的纖維素酶在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中，將會(huì)比一千報(bào)道的纖維素 酶更有應(yīng)用價(jià)值。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的是提供一種酸性、底物特異性比較廣泛的纖維素酶。
[0008] 本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的基因。
[0009] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶的重組載體。
[0010] 本發(fā)明的再一目的是提供包含上述纖維素酶基因的重組菌株。
[0011] 本發(fā)明的再一目的是提供一種制備纖維素酶的方法。
[0012] 本發(fā)明的再一目的是提供上述纖維素酶的應(yīng)用。
[0013] 本發(fā)明首先所要解決的技術(shù)問題是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種性質(zhì)優(yōu)良的、 適合于在飼料、食品、醫(yī)藥等行業(yè)中應(yīng)用的新的纖維素酶，其氨基酸序列如SEQIDNO. 1 :
[0014] 別FTWYDLSSIDKFMAQGV畑FRLNFLME化TPNNLTAPLDPLYLGNLTEQV101NYITAKGAYAMIQPHNYGRFMGEIITDTAGFKTWKNVAAEYKDNDLVVF 巧1DTNNEYHDMDQKLVTDLNQAAIDGVREAGATKQYITPEGNSWTGAWT保VS 201SGNAA化VAL邸巧NKLIYQM明YLDVDGSGTHAECVSATVFR邸LVAAT 251QWLKANNKQGVIGGFAAGVNEQCVAALQDGLAYLAENGDV\WGAMWAAG 301 鞠帶謝YMYSMEP盼GPAWVGILPKI盼YFV*
[0015] 其中，該酶全長330個(gè)氨基酸，N端19個(gè)氨基酸為信號(hào)膚序列 "MFFSKLAVSIAALASSATA"。
[0016] 因此，成熟的纖維素酶Cel5的理論分子量為35kDa，其氨基酸序列如SEQID NO. 2 ：
[0017] 1Q肥TKKLKWFGINESGAEFG邸N巧GVYGKE巧WYDLSSIDKFMAgGV畑 日 1FRLNFLME化TPMLTAPLDPL化GNLTEQVNYITAKGAYAMIQPHNYGR
[0018] 101FMGE口TDTAG陸TWWKNVAAEY邸NDLW抑TNNE抑DMD孤LV邱LN日 151AAIDGV陸AGATKQYIT把G腿印TGAWTWV泌GNAASLVAL邸PSNKLIY 201QM明YLDVDGSGTHAECVSATVFRERLVAATQWLKANNKQGn犯FAAGV 25,1NEQCVAALQDGLAYLAENGDVWfGAMffWAAGPW1GDYMYSMEPESGPAWV 301GELPKIKSYFV
[0019] 該纖維素酶的最適抑為5. 0,在抑4. 5-P冊(cè).0范圍內(nèi)，該酶能夠維持其70%W上 的酶活力；最適溫度60°C，在70°C時(shí)依然具有50%W上的酶活力，在50°C下處理60min，剩 余酶活在80%W上，在60°C下處理20min，依然能夠保持37%的酶活力，具有良好的穩(wěn)定 性。
[0020] 本發(fā)明還提供了編碼上述纖維素酶的基因。該酶的全基因序列如SEQIDNO. 3所 示：
[0021] I ATGTTCTTCA GCAAACTCGC TGTTTCTATC GCGGCGCTAG CCTCGTCAGC TACGGCGCAA 61 AACTCGACCA AGAAGCTGAA ATGGTT說GC ATCAATGAGT說GG說CTGA GTTTGGCGAG 121 AAGAACTTCA CGGGTGTGTA TGGCAAGGAG TTCACAT說T ACGATCTCTC CAGCATCGAC 181 AAATTCATGG CCCAAGGCGT CAACCACTTC CGTCTCAACT TCCGTAAGTT ATGCCACCCG 241 TCTACGTAAA CACCCACCAT AGGACTCCCA AACCTAACGT GACGACCAAC AGTAATGGAA 301 CGCCTCACCC CCAACAACCT CACCGCCCCC CTCGACCCAC TCTACCTCGG CAATCTCACC 361 GAGCAAGTTA ACTATATAAC CGCAMAGGC GCCTACGCCA TGATCCAACC GCACAACTAC 421 GGCCGCTTCA TGGG說AAAT CATCACCGAC ACAGCCGGCT TCAMACATG GTGGAAGAAC 4別GTAGCCGCAG AGTACAAAGA CAACGACCTC CTCGTCTTCG ACACAAACM CGAATACCAC 541 GACATGGATC AGAAACTCGT GTTTGATCTC AACCAAGCCG CCATCGACGG CGTACGCGAG 601 GCAGGCGCAA CGAAGCAATA CATCACCCCT GAGGGGAACT CGTGGACGGG CGCTTGGACG 6日1 TGGGTAAGCA G說GTAACGC CGCCAGTCTC GTCGCCCTCA AAGACCCCTC GAACAAACTG 721 ATCTACCAAA TGCATCAATA CCTCGATGTA GAC說CAGCG GTACGCACGC TGAATGCGTT 781 TCCG說AC說TTTTC餅CGA GA說燈KTG GCGGCTA說C AGTGGCTCAA GG說AATAAC 841 AAGCAAGGTG TTATTGGCGA GTTTGCTGCC朋CGTGMTG AGCAGTGTGT GGCCGCGTTG 901 CAGGATGGGT TGGCCTATTT GGCGGAGAAT GGGGATGTGT GGTGGGGCGC TATGTGGTGG 961 GCTGCTGGGC CTTGGTGGGG GGATTATATG TATAGTATGG AGCCTGAGAG TGGGCCGGCT 1021 TGGGTGGGGA TTTTGCCGAA GATTAAGTCG TATTTTGTGT AA
[0022] 本發(fā)明通過PCR的方法分離克隆了運(yùn)個(gè)纖維素酶基因Cel5, DNA全序列分析結(jié)果 表明，纖維素酶Cel5結(jié)構(gòu)基因全長1062bp，含有1個(gè)內(nèi)含子，巧24~292bp為其內(nèi)含子序 列，cDNA長993bp，其cDNA序列如沈Q ID NO. 4所示：
[0023] I ATGTTCTTCA GCAAACTCGC TGTTTCTATC GCGGCGCTAG CCTCGTCAGC TACGGCGCAA 61 AACTCGACCA AGAAGCTGM ATGGTTCGGC ATCAATGAGT CGGGCGCTGA (}TTTGGCGAG 121 AAGAACTTCA CGGGTGTGTA TGGCAAGGAG TTCACATGGT A說AT燈CTC CAGCATCGAC 181 AAATTCAT說CCCAAGGCGT CAACCACTTC CGTCTCAACT TCCTAATGGA ACGCXTCACC 241