CCCAACAACC TCACCGCCCC CCTCGACCCA CTCTACCTCG GCAATCTCAC CGAGCAAGTT 301 AACTATATAA CCGCAAAAGG CGCCTACGCC ATGATCCMC CGCACAACTA CGGCCGCTTC 361 ATGGGCGAAA TCATCACCGA CACAGCCGGC TTCAAAACAT GGTGGAAGAA CGTAGCCGCA 421 GAGTACAAAG ACAACGACCT CGTCGTCTTC GACACAAACA ACGAATACCA CGACATGGAT 481 CAGAAACTCG TGTTTGATCT CAACCAAGCC GCCATCGACG GCGTACGCGA GGCAGGCGCA 541 ACGAAGCAAT ACATCACCCC TGAGGGGAAC TCGTGGACGG GCGCTTGGAC (}TGGGTAAGC 601 AGCGGTAACG CCGCCAGTCT CGTCGCCCTC AAAGACCCCT CGAACAAA燈CATCTACCAA 661 ATGCATCAAT ACCTCGATGT AGACGGCAGC說TACGCACG CTGAATGCGT TTCCGCGACG 721 GTTTTCCGCG AGAGGCTTGT GGCGGCTACG CAGTGGCTCA AGGCGAATAA CAAGCAAGGT 781 GTTATTGGCC AGTTTGCTGC CGGCGTGMT GAGCAGTGTG TGCCCGCGTT GCAGGATGGG 841 TT說CCTATT TGG說GAGAA TGGGGATGTG TGGTGG說CG CTATGT說TG GGCTGCTGGG 901 CCTTGGTGGG GGGATTATAT GTATAGTATG GAGCCTGAGA GTGGGCCGGC TTGGGTGGGG 961 ATTTTGCCGA AGATTAAGTC GTATTTTGTG TAA
[0024] 其中，信號(hào)膚的堿基序列為：
[00巧]"ATGTTCTTCA GCAAACTCGC TGTTTCTATC GCGGCGCTAG CCTCGTCAGCT ACGGCG"
[0026]因此，成熟基因的編碼序列為
[0027] SEQ ID NO. 5所示：
[0028] 1 CAAAACTCGA CCAAGAAGCT GAAATGGTTC GCtCATCAATG AGTCGGCtCGC TGAGTTTGGC貸1 GAGAAGAACT TCACGGGTGT GTATGGCAAG GAGTTCACAT說TACGATCT CTCCAGCATC 121 GACAMTTCA TGGCCCAAGG CGTCAACCAC TTCCGTCTCA ACTTCCTAAT GGAACGCCTC 181 ACCCCCAACA ACCTCACCGC CCCCCTCGAC CCACTCTACC TCGGCAATCT CACCGAGCAA 241 GTTAACTATA TAACCGCAAA AGGCGCCTAC GCCATGATCC AACCGCACAA CTACGGCCGC 301 TTCATGGGCG AAATCATCAC CGACACAGCC GGCTTCAAAA CATGGTGGAA GAACGTAGCC 361 GCAGAGTACA AAGACAACGA CCTC燈說TC TTCGACACAA ACAACGAATA CCACGACATG 421 GATCAGAAAC TCGTGTTTGA TCTCAACCAA GCCGCCATCG ACGGCGTACG CGAGGCAGGC 姑1 GCAA說AAGC AATACATCAC CCCTGAGGGG AACTCGTGGA說GGCGCTTG GACGTGGGTA 541 AGCAGCGGTA AC成CGCCAG TCTCGTC成C CTCAAAGACC CCTCGAACAA ACTCATCTAC 601 CAAATGCATC AATACCTCGA TGTAGACGGC AGCGGTACGC ACGCTGAATG CGTTTCCGCG 661 ACGGTTTTCC GCGAGAGGCT TGTGGC說CT ACGCAGT說C TCAAGGCGAA TAACAAGCAA 721 GGTGTTATTG: GCGAGTTTGC TGCCGGCGTG MTGAGCAGT GTGTGGCCGC GTTGCAGGAT
[0029] 781 GGGTT說CCT ATTTGGCGGA GAATGGGGA了GTCT說TGGG GCG燈ATGTG GTGGGCTGCT 841 GGGCCTTGGT GGGGGGATTA TATGTATAGT ATGGAGCCTG AGAGTGGGCC GGCTTGGGTG 901說GATTTTGC CGAAGATTAA GTCGTATTTT GTGTAA
[0030] 成熟蛋白理論分子量為35kDa，該酶屬于糖基水解酶第5家族。將纖維素酶基因 Cel5CDNA序列及推導(dǎo)出的氨基酸序列在GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)發(fā)現(xiàn)，確定Cel5是一 種新的纖維素酶。
[0031] 本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組載體，優(yōu)選為pPIC9-cel5。將本發(fā) 明的纖維素酶基因插入到表達(dá)載體合適的限制性酶切位點(diǎn)之間，使其核巧酸序列可操作的 與表達(dá)調(diào)控序列相連接。作為本發(fā)明的一個(gè)最優(yōu)選的實(shí)施方案，優(yōu)選為將纖維素酶基因插 入到質(zhì)粒PPIC9上的EcoRI和NotI限制性酶切位點(diǎn)之間，使該核巧酸序列位于AOXl啟 動(dòng)子的下游并受其調(diào)控，得到重組酵母表達(dá)質(zhì)粒pPIC9-cel5。
[0032] 本發(fā)明還提供了包含上述纖維素酶基因的重組菌株，優(yōu)選為重組菌株GS115/ cel5〇
[0033] 本發(fā)明還提供了一種制備纖維素酶的方法，包括W下步驟：
[0034] 1)用上述重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，得重組菌株；
[003引。培養(yǎng)重組菌株，誘導(dǎo)重組纖維素酶的表達(dá)擬及
[0036] 3)回收并純化所表達(dá)的纖維素酶。
[0037] 其中，優(yōu)選所述宿主細(xì)胞為畢赤酵母（Pichiapastoris)細(xì)胞、啤酒酵母 (Saccharomycescerevisiae)細(xì)胞或多型漢遜酵母（Hansenulapolymo巧ha)細(xì)胞，優(yōu)選 將重組酵母表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化畢赤酵母細(xì)胞（Pichicpasto;ris)GS115,得到重組菌株GS115/ cel5〇
[0038] 本發(fā)明還提供了上述纖維素酶的應(yīng)用。運(yùn)用基因工程手段來產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)纖維素 酶。
[0039] 本發(fā)明提供了一個(gè)新的纖維素酶基因，可作應(yīng)用于飼料、食品、醫(yī)藥等工業(yè)。根據(jù) 本發(fā)明的技術(shù)方案就可W實(shí)現(xiàn)利用基因工程手段生產(chǎn)性質(zhì)優(yōu)良適合工業(yè)應(yīng)用的纖維素酶。
【附圖說明】
[0040] 圖1本發(fā)明重組纖維素酶的最適抑值。
[0041] 圖2本發(fā)明纖維素酶的抑穩(wěn)定性。
[0042] 圖3本發(fā)明纖維素酶最適反應(yīng)溫度。
[0043] 圖4本發(fā)明纖維素酶熱穩(wěn)定性。
【具體實(shí)施方式】
[0044] 試驗(yàn)材料和試劑
[0045] 1、菌株及載體：畢赤酵母（PichiapastorisGS115)為本實(shí)驗(yàn)室保存；畢赤酵母 表達(dá)載體pPIC9及菌株GSl15購自于Invitrogen公司。
[0046] 2、酶類及其它生化試劑：內(nèi)切酶購自TaKaRa公司，連接酶購自Invitrogen公司， 其它都為國產(chǎn)試劑（均可從普通生化試劑公司購買得到）。
[0047] 3、培養(yǎng)基：
[0048] (I)產(chǎn)酶培養(yǎng)基：30g/L麥教，30g/L玉米忍粉，30g/L豆巧，5g/L大麥葡聚糖，5g/ L(NHa)SO"Ig/L皿2口〇4,〇. 5g/LM拆〇4? 7&0,0.Olg/LFeS〇4? 7&0,0. 2g/LCaClz于IL去 離子水中，12TC，15磅條件下滅菌處理20min
[0049] (2)大腸桿菌培養(yǎng)基LB(126蛋白腺、0. 5%酵母提取物、126化Cl,pH7. 0)。
[0050]做BMGY培養(yǎng)基；1 %酵母提取物，2 % 蛋白腺，1. ：34 %YNB，0. 000049<Biotin，1 % 甘油（v/v)。
[0051] (4)BMMY培養(yǎng)基：除W0. 5 %甲醇代替甘油，其余成份均與BMGY相同，pH4. 0。
[0052] 說明：W下實(shí)施例中未作具體說明的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法，均參照《分子克隆實(shí)驗(yàn) 指南》（第=版）J.薩姆布魯克一書中所列的具體方法進(jìn)行，或者按照試劑盒和產(chǎn)品說明書 進(jìn)行。
[0053] 實(shí)施例1纖維素酶編碼基因cel5的克隆
[0054]提取Prostheciumopalus基因組DNA
[00巧]將液體培養(yǎng)3天的菌，12, 00化pm離屯、lOmin，收集的菌絲體加入已高溫滅菌的研 鉢中，用液氮迅速研磨至粉末，然后將研磨好的菌體轉(zhuǎn)移至一個(gè)新的，裝有15mlCTAB裂解 液50血離屯、管中，輕柔上下倒置混勻，置于65°C水浴鍋保溫化，每隔20min，上下倒置輕柔 混勻一次，W便充分裂解菌體。4°C、12, 00化pm離屯、lOmin，吸取上清至新的離屯、管中，加入 等體積的氯仿抽提，室溫放置5min。4°C、12, 00化pm離屯、lOmin。取上清再加入等體積的酪 /氯仿抽提，室溫放置5min。4°C、12,00化pm離屯、lOmin。W便盡量除去雜蛋白，再取上清 加入等體積異丙醇，于室溫靜置5min后，4°C下100