Rp11-1023l17.1作為前列腺癌分子靶標及其在診斷試劑盒中的應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體設(shè)及一種前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1及 其在診斷試劑盒中的應(yīng)用，包括通過該生物分子祀標在前列腺癌高危人群的篩選、前列腺 癌的診斷、前列腺癌治療及狀況的監(jiān)測、前列腺癌指導(dǎo)用藥的監(jiān)測及前列腺癌預(yù)后檢測等 領(lǐng)域的應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 根據(jù)《ASC0年度報告：2015臨床腫瘤學(xué)進展》中相關(guān)內(nèi)容，液體活檢技術(shù)被 列為腫瘤治療領(lǐng)域下一個十年趨勢之一。血液中的一些分子標志物已經(jīng)被應(yīng)用于一些 疾病的診斷，如谷丙轉(zhuǎn)氨酶用于肝炎的診斷，白細胞數(shù)目用于判斷炎癥。血液循環(huán)腫瘤 DNA(circulatingtumorDNA，CtDNA)是一種無細胞狀態(tài)的胞外游離DNA，存在于血液、滑膜 液和腦脊液等體液中，體細胞DNA經(jīng)脫落或者當(dāng)細胞調(diào)亡后釋放進入循環(huán)系統(tǒng)，其主要是 由短的單鏈或雙鏈DNAW及單鏈與雙鏈DNA的混合物組成，WDNA蛋白質(zhì)復(fù)合物或游離DNA 兩種形式存在。CtDNA來自腫瘤細胞的體細胞突變，因此，CtDNA是一種特征性的新的腫瘤 生物標記物，并且還可W被定性、定量和追蹤，將成為臨床腫瘤的早期診斷、預(yù)后判定及跟 蹤隨訪等提供一系列方便、快捷、特異、無創(chuàng)或微創(chuàng)和分子生物學(xué)檢測手段，尤其對于一些 不具有典型臨床癥狀、檢查無特異性和診斷困難的腫瘤可避免復(fù)雜的、具有創(chuàng)傷性的活檢。 結(jié)合新一代測序技術(shù)（NG巧將變成"液體活檢"，并替代侵入組織性活檢。
[0003] RP11-102：3L17. 1 屬于IncRNA(Ion即on-codingRNA，長鏈非編碼RNA)，是一類轉(zhuǎn) 錄本長度超過200個核巧酸的非編碼RNA，近年研究發(fā)現(xiàn)它是一類具有重要生物學(xué)功能的 RNA，參與基因組印記、染色體沉默、染色質(zhì)修飾、轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾、核內(nèi)運輸?shù)榷喾N重要 的調(diào)控過程，在細胞分化和發(fā)育、基因轉(zhuǎn)錄和翻譯、遺傳和表觀遺傳等生命活動中均發(fā)揮重 要的調(diào)控作用。近年來，越來越多的權(quán)威研究證實IncRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起著抑制或 促進腫瘤的作用，在調(diào)控腫瘤細胞增殖、調(diào)亡、細胞周期、侵襲轉(zhuǎn)移能力等方面，均具有十分 重要作用。目前己有較多IncRNAs被證實在包括乳腺癌、前列腺、黑色素瘤、肝癌、結(jié)腸癌、 膀脫癌等在內(nèi)的人類多種腫瘤中存在差異表達并執(zhí)行重要的調(diào)控功能。早期有效檢測腫瘤 的發(fā)生、發(fā)展及提高抗癌藥物的療效對于癌癥的治療尤為重要，發(fā)明新型腫瘤標志物作為 診斷與治療的祀點一直是腫瘤研究的熱點。
[0004] 前列腺癌是常見的男性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤之一。世界范圍內(nèi)，前列腺癌發(fā)病率在 男性所有惡性腫瘤中位居第二，在美國前列腺癌的發(fā)病率已經(jīng)超過肺癌，成為第一位危害 男性健康的腫瘤。亞洲前列腺癌的發(fā)病率遠遠低于歐美國家，但近年來呈現(xiàn)上升趨勢，且增 長比歐美發(fā)達國家更加迅速。前列腺癌患者主要是老年男性，一般在50歲W后發(fā)病，95%發(fā) 生于60歲W上的老年男性，發(fā)生率持續(xù)地隨著年齡增長而增加。前列腺癌早期多無任何癥 狀，即使有所不適，也不足W引起病人的重視，當(dāng)腫瘤增大壓迫尿道時，又往往與前列腺增 生相混淆。在我國約80%的病人首先發(fā)現(xiàn)遠處轉(zhuǎn)移病灶才發(fā)現(xiàn)前列腺癌。此時，病變已達 晚期，預(yù)后不良。 陽0化]前列腺癌的臨床診斷方式目前主要有直腸指檢、血清前列腺特異性抗原（PSA)檢 、直腸超聲波檢測、活組織病理檢查等。直腸指檢是最簡單、最經(jīng)濟實用的方法，主要通過 醫(yī)生的食指觸摸前列腺，用W發(fā)現(xiàn)很多無癥狀的前列腺癌患者，有可能獲得早期診斷及根 治的機會。但W上的方法都存在局限性。例如直腸指檢的局限性主要在4個方面：（1)患者 前列腺腫塊不大時，易漏診；（2)部分患者前列腺癌腫大不明顯，但已屬于晚期，不易根治； (3)患者直腸有疾患時不能使用此檢測；（4)醫(yī)生經(jīng)驗不足時可能有漏診或者誤診的可能。 正常情況下血液中的PSA不高(不高于4ng/ml),當(dāng)處于前列腺癌及其他前列腺疾病患病 狀態(tài)時，PSA升高成為目前篩查前列腺癌最敏感的瘤標，但其也存在一定局限性：（1)需要 取血檢測，對患者有一定的損傷；（2)PSA增高也常見與非前列腺癌疾病，如前列腺炎癥、前 列腺肥大等，因此不易確診；（3)PSA增高確診前列腺癌時，往往患者已經(jīng)屬于中后期，達不 到早期診斷的目的。前列腺超聲波檢測操作簡單直觀、無損傷，通過顯示腫塊的大小、數(shù)目、 位置、密度、邊緣、形體、有無巧化及巧化的形態(tài)、大小、數(shù)目、分布W及周圍的暈環(huán)、皮膚改 變等提供定位及定性征象并判斷病變的性質(zhì)；其局限性是：（1)對致密性的小癌灶容易漏 診；（2)有時候不能提供明確的定性診斷；（3)因其不能顯示腫瘤的內(nèi)部結(jié)構(gòu)及周圍組織所 W診斷符合率很低；（4)對一些缺乏典型征象的實性良惡性腫塊有較高的誤診率?；罱M織 病理檢查因其創(chuàng)傷性、復(fù)雜性不能作為初篩的手段，但它是前列腺癌確診的金標準，一般與 其他方法技術(shù)連用。
[0006] 近年來的研究表明，IncRNA與前列腺癌密切相關(guān)，它們可能參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展 和轉(zhuǎn)移，所W對腫瘤的發(fā)病機制、早期診斷、個體化治療、轉(zhuǎn)移的檢測和預(yù)后等可能有相應(yīng) 的作用。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一種與前列腺癌相關(guān)的新的前列腺癌分子祀標，W及前列 腺癌診斷試劑盒，W及該前列腺癌分子祀標和前列腺癌診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩 選、診斷、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0008] 本發(fā)明經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)RP11-102化17. 1在前列腺癌組織樣本中的含量比前列腺正常 組織樣本中的含量高，顯示RP11-102化17. 1與前列腺癌的腫瘤發(fā)生、發(fā)展存在著密切的相 關(guān)性。因此，本發(fā)明提出RP11-102化17. 1作為與前列腺癌相關(guān)的新的前列腺癌分子祀標， 并提供含有該前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1 (作為標志物)的診斷試劑盒，W及該分子 祀標或診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1，是一種IncRNA，全長500化口， 其核巧酸序列為SEQIDNO. 1所示。
[0010] 前述的前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1，可用于篩選預(yù)防、緩解和/或治療前 列腺癌的藥物。其抑制劑RP11-102：3L17. 1SiRNA(沈QIDNO. 6、沈QIDNO. 7)可用于制 備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物。
[0011] 本發(fā)明還提供含有前述前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1的診斷試劑盒。該診 斷試劑盒可用于前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測等。
[0012] 前述的前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1作為標志物在制備前列腺癌高危人群 篩選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測的試劑盒中的應(yīng)用，是通過檢測被試者組織樣本、血液 和尿液中的RPl1-102化17. 1的含量，并與正常水平RPl1-102化17. 1含量相比較，W進行前 列腺癌高危人群篩選、診斷、治療狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測。
[0013] 前述的前列腺癌分子祀標RP11-102化17. 1作為標志物在制備前列腺癌高危人群 篩選、診斷、藥物設(shè)計、治療及狀況監(jiān)測、預(yù)后監(jiān)測的試劑盒中及藥物中的應(yīng)用，可把被試者 血清、尿液和組織樣本中RP11-102化17. 1的含量通過總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、定量PCR進行檢 測。
[0014]前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒包括： (1) 組織樣本、血液和尿液中總RNA提取試劑； 每50mg組織或200ul血液或200ul尿液，使用：
(2) 反轉(zhuǎn)錄試劑；
(3) 定量PCR試劑；
引物包括RPl1-102化17. 1和對照0 -ACTIN兩對引物； (4) 前列腺正常組織CDNA 作為陰性對照與檢測樣本cDNA共同定量PCR檢測，每個反應(yīng)體系使用與檢測樣本cDNA相同量。
[0015] 前述的診斷前列腺癌的診斷試劑盒結(jié)果分析檢測樣本和陰性對照間比較采用t檢驗，P<0. 05為差異顯著，判為標本檢測陽性。
[0016]前述檢測試劑盒所用對照為0 -ACTIN，其引物序列如下： e-ACTIN上游引物序列：5 ' -CCTCTCCCAAGTCCACACAG-3 '(沈QIDNO. 2)e-ACTIN下游引物序列：5 ' -GGGCACGAAGGCTCATCATT-3 '(沈QIDNO. 3)。
[0017] 前述檢測試劑盒所檢測RPl1-102化17.I，其引物序列如下： RP11-102：3L17. 1 上游引物序列：5 ' -GATTTACTTTTGGGATACACTCATCAT-3 '(沈QID NO. 4) RP11-102：3L17. 1 下游引物序列：5 ' -ACAGGTGACTTCATCTTGGATTT-3 '(沈QID NO. 5)。
[0018] 本發(fā)明為前列腺癌的診斷和治療提供了一種新的分子祀標RP11-102化17. 1。該 分子祀標的抑制劑可用于制備治療前列腺癌的藥物，同時可作為標志物應(yīng)用于制備診斷試 劑盒中。使用該分子祀標及含有該分子祀標的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡單、取材方 便、安全無創(chuàng)傷，且具有較高的特異性、靈敏性和方便大量篩查的特點。該分子祀標適合應(yīng) 用于前列腺癌高危人群的篩選、前列腺癌的鑒定、前列腺癌治療及狀況的監(jiān)測、前列腺癌指 導(dǎo)用藥的監(jiān)測和前列腺癌預(yù)后監(jiān)測等領(lǐng)域。
【附圖說明】
[0019] 圖1.RP11-102化17. 1在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測。
[0020]圖 2.前列腺癌PC-3 細胞系中RP11-102：3L17.IsiRNA對RP11-102：3L17. 1 沉默效 率。 陽02U 圖3.RPl1-102化17.I-SiRNA顯著抑制前列腺癌細胞的增殖。
[0022] 圖4.藥物SB20580顯著抑制前列腺癌細胞系中RPl1-102化17. 1的表達。
【具體實施方式】
[0023] 為使本發(fā)明更加容易理解，下面結(jié)合具體實施例進一步闡述本發(fā)明，但下述實施 例僅用于說明本發(fā)明而不限制本發(fā)明的范圍，下面實施例中未提及的具體實驗方法，按照 常規(guī)實驗方法進行。
[0024] 實施例1:RP11-102化17. 1在前列腺癌組織樣本中和正常組織樣本中的含量檢測 本實施例主要步驟如下： 1、組織樣本中總RNA的提取 獲得前列腺癌根治術(shù)患者手術(shù)后的組織樣本，同時獲得淋己結(jié)清掃術(shù)的患者切除的組 織樣本作為對照。提取前述組織樣本的總RNA于無DNA和無RNA酶污染的1. 5毫升離屯、管 中。
[00巧]組織樣本中提取總RNA的試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司。提取的總RNA通過使用化ermNanoDrop2000c分光光度計，測定260/280皿紫外波長的比值進行的濃 度測定。 陽0%] 2、定量檢測組織樣本中的IncRNA (O反轉(zhuǎn)錄RNA得到cDNA單鏈 按照下表1配置反轉(zhuǎn)錄體系，配置過程在冰上進行。配置好的體系在PCR儀上進行反 轉(zhuǎn)錄。反應(yīng)條件為38攝氏度15分鐘，85攝氏度5秒。 |；00別表1
表I中X表示加入的RNA體積由RNA濃度來確定，本實驗中為X= 500鋼克/RNA濃