度。前述反轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自大連寶生物有限公司（Takara)。
[0028] (2)QPCR定量檢測(cè) WCDNA稀釋液為實(shí)時(shí)定量PCR模板，引物終濃度為200nM，反應(yīng)總體積為10y1。實(shí) 時(shí)定量PCR儀器使用ABI7900HTsequenceDetectionSystem,用384孔板完成。每個(gè)樣 本重復(fù)二到=次。在溶解曲線基本符合要求無(wú)非特異性擴(kuò)增的情況下，參考操作手冊(cè)，采用 t虹esholdcycle(Ct)方法獲得相對(duì)表達(dá)量，WP-ACTIN為內(nèi)參。具體程序參看表2。
[0029]表 2
[0030] (3)采用ArrayTools4. 1.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 用前述方法可測(cè)得樣品中目標(biāo)IncRNA和參照IncRNA的Ct值水平求得目標(biāo)IncRNA在 組織中的相對(duì)含量。用0-ACTIN為參照矯正IncRNA的量，通過(guò)QPCR檢測(cè)中經(jīng)典的2AU 的方法表示組織樣本中IncRNA的水平（-ACt為目標(biāo)IncRNA與對(duì)照的Ct值之差)。
[0031] 3、組織樣本中RPl1-102化17. 1水平診斷前列腺癌 如圖1，與正常對(duì)照組織樣本中RP11-102化17. 1的高含量相比，前列腺癌患者組織樣 本中的RP11-102化17. 1含量相對(duì)較高，且普遍高于正常組織樣本的平均值，正常樣本平均 值約為腫瘤樣本的平均值的2. 5倍，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
[0032] 實(shí)施例2:前列腺癌細(xì)胞系中RP11-102：3L17.I-SiRNA對(duì)RP11-102：3L17. 1沉默效 率檢測(cè) 本實(shí)施例中使用的前列腺癌分子祀標(biāo)RP11-102化17. 1的SiRNA序列為：RP11-102：3L17. 1SiRNA正義鏈序列：5'-GCGUCUAAGAGAGUACUUU-3'(沈QIDNO. 6) RP11-102：3L17. 1SiRNA反義鏈序列：5'-AAAGUACUCUCUUAGACGC-3'(沈QIDNO. 7)。 陽(yáng)〇3引使用的陰性對(duì)照（NC)的SiRNA序列為： NCSiRNA正義鏈序列：5 '-UUCUCCGAACGUGUCACGU-3 '(沈QIDNO. 8) NCSiRNA反義鏈序列：5 '-ACGUGACACGUUCGGAGAA-3 '(沈QIDNO. 9)。
[0034] 本實(shí)施例主要步驟如下： 1、細(xì)胞的SiRNA轉(zhuǎn)染（W六孔板為例） 將前列腺癌PC-3細(xì)胞系接種到六孔板中，使得次日的細(xì)胞匯合度約40-50%，將5yL的Lipofectamine2000 和 250yLOpti-MEM混合解育，同時(shí)將加 1 20uM/L的SiRNA與 250yL 化ti-MEM混合解育。靜置5min后將兩者混合。同時(shí)將細(xì)胞用PBS洗一遍，換成1. 5ml的 化ti-MEM。轉(zhuǎn)染混合物靜置20min后，均勻滴加到六孔板中，SiRNA的終濃度為50uM/ml。 4-6小時(shí)后更換成完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。 陽(yáng)03引2、細(xì)胞中總RNA的提取 細(xì)胞轉(zhuǎn)染并培養(yǎng)4化后，收集細(xì)胞并提取其總RNA，提取方法同實(shí)施例1。
[0036] 3、定量檢測(cè)細(xì)胞中的IncRNA并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 定量檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析方法同同實(shí)施例1。
[0037] 4、RP11-102：3L17. 1SiRNA對(duì)RP11-102：3L17. 1 沉默效率 如圖 2,在PC-3 轉(zhuǎn)染RP11-102：3L17. 1SiRNA之后，RP11-102：3L17. 1 的表達(dá)量下降了 80%^上。證明3?11-102化17.1311?酷可^有效敲減1??11-102化17.1在前列腺癌口(：-3 細(xì)胞系中的表達(dá)。
[0038] 實(shí)施例3:RP11-102化17. I-SiRNA顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，可用于前列腺 癌藥物的制備。
[0039] 本實(shí)施例主要步驟如下： 1、細(xì)胞的SiRNA轉(zhuǎn)染六孔板為例） 轉(zhuǎn)染方法同實(shí)施例2。 W40] 2、細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 細(xì)胞消化后重懸，接種于96孔中，并設(shè)置只加100yL1640培養(yǎng)基的對(duì)照孔。接種化、 24h、4化后，每孔分別加入IOulCKK-8試劑后，細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)解育2小時(shí)。使用在酶標(biāo) 儀檢測(cè)波長(zhǎng)450nm處各孔的光吸收值（0D)，參比波長(zhǎng)630nm化00-650nm)。W各孔光吸收值 減去空白孔光吸收值的平均值作為實(shí)際光吸收值，取平均值，W化、24h、4化時(shí)間點(diǎn)光吸收 值作曲線，反映細(xì)胞的增殖情況。 陽(yáng)0川 3、RPl 1-102化17. I-SiRNA影響前列腺癌細(xì)胞的增殖情況 如圖3, RP11-102化17. I-SiRNA顯著抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，可用于前列腺癌藥物 的制備。
[0042] 實(shí)施例4:藥物SB20580能顯著抑制前列腺癌細(xì)胞系中RP11-102化17. 1的表達(dá)， 可作為潛在前列腺癌的藥物。
[0043] 本實(shí)施例主要步驟如下： 1、細(xì)胞的處理 將前列腺癌PC-3細(xì)胞系接種到六孔板中，使得次日的細(xì)胞匯合度約70%，第二天將正 常的培養(yǎng)基更換為含有濃度為10yM的培養(yǎng)基，分別培養(yǎng)0小時(shí)，2小時(shí)，4小時(shí)。
[0044] 2、細(xì)胞中總RNA的提取 收集細(xì)胞并提取其總RNA，提取方法同實(shí)施例1。 W45] 3、定量檢測(cè)細(xì)胞中的IncRNA并進(jìn)行數(shù)據(jù)分析 定量檢測(cè)及數(shù)據(jù)分析方法同同實(shí)施例1。
[0046] 4、藥物SB20580 對(duì)RP11-102：3L17. 1 的抑制率 如圖4,在使用藥物SB20580對(duì)細(xì)胞處理之后，RPl1-102化17.I的表達(dá)量在化和地后 分別下降了 35%和55%W上。證明藥物SB20580可W有效抑制RP11-102化17. 1在前列腺 癌PC-3細(xì)胞系中的表達(dá)，可作為潛在前列腺癌的藥物。
[0047] 實(shí)施例5:本前列腺癌的診斷試劑盒的應(yīng)用 本實(shí)施例主要步驟如下： 1、組織樣本、血液、尿液中總RNA的提取 按照每50mg組織或200ul血液或200ul尿液使用1血的Trizol試劑的量處理組織樣 本、血液、尿液，吹打均勻后轉(zhuǎn)移到無(wú)RNA酶的1. 5ml化管中；向勻漿中加入1/5體積的氯 仿，振蕩離屯、管至溶液乳化成乳白狀，無(wú)分相，12000巧m4°C離屯、15min;吸取上清至新管， 加入等體積異丙醇，輕輕混勻，-20°C化沉淀；12000巧m4°C離屯、IOmin;棄上清，沿管壁輕 輕加入Iml75%乙醇，輕洗EP管，12000巧m4°C離屯、2min;棄上清，短暫離屯、，用槍吸去剩 余上清，置于通風(fēng)楓內(nèi)驚干；加入適量DEPC水，用槍吹打使沉淀溶解；定量：電泳檢測(cè)抽提 質(zhì)量，紫外分光光度計(jì)檢測(cè)0D260/0D280和樣品濃度；得到組織樣本、血液、尿液中總RNA， 放置-80°C保存。
[0048] 2、檢測(cè)組織樣本、血液、尿液中的RP11-102化17. 1相對(duì)前列腺正常組織表達(dá)量變 化 使用試劑盒中試劑，按照實(shí)施例1中反應(yīng)體系與條件，使用試劑盒中前列腺正常組織CDNA作為QPCR定量檢測(cè)中的對(duì)照cDNA，檢測(cè)組織樣本、血液、尿液中的RPl1-102化17. 1相 對(duì)前列腺正常組織表達(dá)量變化，分析檢測(cè)結(jié)果，樣本和對(duì)照間比較采用t檢驗(yàn)，P<0. 05為差 異顯著，判為檢測(cè)樣本陽(yáng)性。
[0049] 本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說(shuō)明書(shū)中描述的只是說(shuō)明本發(fā)明的 原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，運(yùn)些變化和改 進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。本發(fā)明要求保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書(shū)及其等效物 界定。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種前列腺癌分子靶標(biāo)，其特征在于為RP11-1023L17. 1，是一種IncRNA，其核苷酸 序列為SEQ ID NO. 1所示。2. 如權(quán)利要求1所述的前列腺癌分子靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥 物中的應(yīng)用。3. -種如權(quán)利要求1所述的前列腺癌分子靶標(biāo)的抑制劑。4. 如權(quán)利要求3所述的抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于所述抑制劑制備的藥物包括 RP11-1023L17.1 的 siRNA。6. -種前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于含有前列腺癌分子靶標(biāo)RP11-1023L17. 1， RP11-1023L17. 1是一種IncRNA，其核苷酸序列為SEQ ID NO. 1所示。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的前列腺癌診斷試劑盒，其特征在于包括： (1) 組織樣本、血液和尿液中總RNA提取試劑； (2) 反轉(zhuǎn)錄試劑； (3) 定量PCR試劑； 引物：為RP11-1023L17. 1和對(duì)照P -ACTIN兩對(duì)引物； 對(duì)照P-ACTIN的引物序列如下： 0-ACTIN上游引物序列：SEQ ID NO. 2 0 -ACTIN下游引物序列：SEQ ID NO. 3 ; 檢測(cè)RP11-1023L17. 1的引物序列如下： RP11-1023L17. 1 上游引物序列：SEQ ID NO. 4 RP11-1023L17. 1 下游引物序列：SEQ ID NO. 5。8. 如權(quán)利要求1所述的前列腺癌分子靶標(biāo)作為標(biāo)志物在制備前列腺癌高危人群 篩選、診斷、藥物設(shè)計(jì)、治療及狀況監(jiān)測(cè)、預(yù)后監(jiān)測(cè)的試劑盒中及藥物中的應(yīng)用，其特征 在于：通過(guò)檢測(cè)被試者血清、尿液和組織樣本中RP11-1023L17. 1的含量，并與正常水平 RP11-1023L17. 1含量相比較，以進(jìn)行前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監(jiān)測(cè)、預(yù)后 監(jiān)測(cè)。9. 如權(quán)利要求1所述的前列腺癌分子靶標(biāo)作為標(biāo)志物在制備前列腺癌高危人群篩選、 診斷、藥物設(shè)計(jì)、治療及狀況監(jiān)測(cè)、預(yù)后監(jiān)測(cè)的試劑盒中及藥物中的應(yīng)用，其特征在于：所述 被試者血清、尿液和組織樣本中RP11-1023L17. 1的含量通過(guò)總RNA提取、反轉(zhuǎn)錄、定量PCR 進(jìn)行檢測(cè)。10. -種用于檢測(cè)前列腺癌分子靶標(biāo)RP11-1023L17. 1的引物序列： 上游引物序列：5 ' -GAITTACTITTGGGATACACTCATCAT-3 ' 上游引物序列：5 ' - ACAGGTGACTTCATCTTGGAITT -3 '。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，具體為RP11-1023L17.1作為一種前列腺癌分子靶標(biāo)及其在診斷試劑盒中的應(yīng)用。RP11-1023L17.1是一種lncRNA，其核苷酸序列為SEQ？ID？NO.1所示。本發(fā)明包括該前列腺癌分子靶標(biāo)在篩選預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用；包括該前列腺癌分子靶標(biāo)的抑制劑，以及該抑制劑在制備預(yù)防、緩解和/或治療前列腺癌的藥物中的應(yīng)用；包括含有前列腺癌分子靶標(biāo)的前列腺癌診斷試劑盒；還包括該前列腺癌分子靶標(biāo)和診斷試劑盒在前列腺癌高危人群篩選、診斷、治療及狀況監(jiān)測(cè)、預(yù)后監(jiān)測(cè)中的應(yīng)用等。使用該分子靶標(biāo)及含有該分子靶標(biāo)的診斷試劑盒診斷前列腺癌，操作簡(jiǎn)單、取材方便、安全無(wú)創(chuàng)傷，且具有較高的特異性和靈敏度及易于大量篩查的特點(diǎn)。
【IPC分類(lèi)】C12N15/11, A61K48/00, C12Q1/68, A61P35/00, C12N15/113
【公開(kāi)號(hào)】CN105154448
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510590470
【發(fā)明人】李瑤, 鮑升林, 黃文華, 萬(wàn)學(xué)超, 張亞龍, 吳海
【申請(qǐng)人】復(fù)旦大學(xué), 上海濟(jì)遠(yuǎn)生物科技有限公司
【公開(kāi)日】2015年12月16日
【申請(qǐng)日】2015年9月16日