一種嗜酸乳酸桿菌連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化紅花籽油合成共軛亞油酸的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及用嗜酸乳酸桿菌連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化紅花籽油合成共軛亞油酸的方法，屬于食品加工技術(shù)領(lǐng)域。
【背景技術(shù)】
[0002]共軛亞油酸是亞油酸具有共軛雙鍵的所有位置和幾何異構(gòu)體的統(tǒng)稱，是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種功能性油脂。醫(yī)學(xué)研究表明，CLA除了具有很強(qiáng)的抗癌功能，還具有降脂減肥、調(diào)節(jié)人體代謝、降膽固醇、抗動(dòng)脈粥樣硬化，調(diào)節(jié)血糖、防治糖尿病、提高免疫力、抗氧化、調(diào)高骨骼密度和改善睡眠等功能，因此引起國(guó)際醫(yī)學(xué)界、營(yíng)養(yǎng)學(xué)界的廣泛關(guān)注。大多數(shù)食物中含有CLA，但是CLA的含量一般都很低，專家建議，每人每天補(bǔ)充共軛亞油酸的量為I?3克較為適宜，這即使在以乳制品和動(dòng)物性食品為主食的西方國(guó)家也難以達(dá)到。因此從天然來源中大量分離得到用于保健等用途的CLA難以滿足人們的需求，進(jìn)行人工合成CLA是很好的解決辦法。
[0003]目前生產(chǎn)CLA主要采用化學(xué)法，特別是LA的堿法異構(gòu)化，在工業(yè)上被廣泛采用。但是化學(xué)法得到的產(chǎn)物為一系列具有位置和幾何異構(gòu)體的CLA的混合物，還有環(huán)化等副產(chǎn)物存在，分離獲得單一異構(gòu)體非常困難。而微生物法反應(yīng)條件溫和、生成的CLA異構(gòu)體單一，與天然食物中CLA異構(gòu)體組成相似，有利于產(chǎn)品的開發(fā)應(yīng)用，逐漸得到人們的重視。
[0004]近幾年來利用微生物靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化生成CLA為眾多研究者所關(guān)注，這是由于微生物細(xì)胞轉(zhuǎn)化技術(shù)操作簡(jiǎn)單，在反應(yīng)體系中干擾物質(zhì)少，不易染菌，更有利于下游的純化和檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。紅花籽油來源廣泛，價(jià)格比亞油酸低廉，而且是植物油中其亞油酸含量是最高的，約72-85%，這些亞油酸在乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶的作用下可轉(zhuǎn)化生成附加值極高的CLA0
[0005]李鵬等研究了用游離態(tài)的嗜酸乳酸桿菌轉(zhuǎn)化紅花籽油，發(fā)酵60h，CLA的合成量為94.7yg/mlo對(duì)嗜酸乳酸桿菌進(jìn)行紫外誘變，并進(jìn)行響應(yīng)面法優(yōu)化后，反應(yīng)36h，，CLA的合成量為311.79 μ g/ml (李鵬，產(chǎn)共軛酸菌株的篩選與發(fā)酵條件的優(yōu)化.大連工業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文，2010年)。可見，游離態(tài)的嗜酸乳酸桿菌轉(zhuǎn)化合成CLA的效率并不高，經(jīng)過誘導(dǎo)得到的菌株，合成CLA的效率增加了 2倍多。本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，紫外誘變是隨機(jī)事件，不一定能保證得到符合目標(biāo)的高產(chǎn)菌株。
[0006]菌株固定化可進(jìn)行高密度、多批次的轉(zhuǎn)化，在工業(yè)生產(chǎn)中得到越來越多的重視。李垚等進(jìn)行了嗜酸乳酸桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化菜籽油生成共軛亞油酸的實(shí)驗(yàn)研究，通過將嗜酸桿菌進(jìn)行固定化處理，然后加入生物素將嗜酸乳酸桿菌靜息細(xì)胞透性化處理，可增加細(xì)胞通透性。在該研究中，第一批次CLA產(chǎn)量達(dá)255.01 μ g/ml，然而第二、三次產(chǎn)量均有大幅下降，第四次不到150 μ g/ml，第9次僅為120 μ g/ml左右(圖5.3)，這表明該嗜乳酸桿菌活性下降太快，仍存在改進(jìn)的空間(李垚，嗜酸乳桿菌靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化菜籽油生成共軛亞油酸的研究.南昌大學(xué)碩士研究生論文，2013年.)。
[0007]本領(lǐng)域技術(shù)人員公知，微生物的狀態(tài)，培養(yǎng)基、反應(yīng)底物的組成，反應(yīng)條件(溫度、PH、含氧量等)等各種因素都會(huì)影響微生物的發(fā)酵效率、甚至是發(fā)酵產(chǎn)物的種類。將嗜酸乳酸桿菌活化后制備種子液、洗滌收集、吸附固定、透性化處理同時(shí)轉(zhuǎn)化各類油脂，這中間的每一步都有可能影響最終的轉(zhuǎn)化效率。
[0008]目前還沒有用固定化嗜酸乳酸桿菌靜息細(xì)胞研究轉(zhuǎn)化紅花籽油合成CLA的報(bào)道，是否可以得到一個(gè)比較滿意的轉(zhuǎn)化效率也不得而知。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009]本發(fā)明提供了一種用乳酸菌靜息細(xì)胞連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化紅花籽油亞油酸合成共軛亞油酸的方法，解決目前生產(chǎn)共軛亞油酸原料緊缺和生產(chǎn)復(fù)雜，效率低，得到的CLA結(jié)構(gòu)不單一以及不能滿足社會(huì)需求等問題。本發(fā)明使用的原料紅花籽油來源廣泛，亞油酸含量豐富，制備工藝溫和，操作簡(jiǎn)單。
[0010]本發(fā)明提供了一種嗜酸乳酸桿菌連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化紅花籽油合成共軛亞油酸的方法，它包括如下操作步驟:
[0011](I)吸附載體的制備；
[0012](2)嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞的吸附固定:
[0013](3)紅花籽油介質(zhì)液的制備；
[0014](4)連續(xù)批次轉(zhuǎn)化紅花籽油介質(zhì)液生成共軛亞油酸:用步驟(2)吸附固定的嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞轉(zhuǎn)化步驟(3)制備的紅花籽油介質(zhì)液。
[0015]其中，步驟⑴中，吸附載體的制備方法如下:
[0016]直徑2?4mm的多孔陶粒，先用0.8?1.2mol/L鹽酸溶液浸泡12h，再用0.8?
1.2mol/L氫氧化鈉溶液浸泡10-15h，水洗至中性，烘干備用。
[0017]多孔陶粒參考鮑騰等的研究方法制備(鮑騰；陳冬；陳天虎等.鐵氧化物生物多孔陶粒的制備工藝及性能，復(fù)合材料學(xué)報(bào)，2014年第2期.)。
[0018]優(yōu)選地，鹽酸溶液的濃度為lmol/L，氫氧化鈉溶液的濃度為lmol/L，氫氧化鈉溶液的浸泡時(shí)間為12h。
[0019]其中，步驟⑵中，嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞的吸附固定方法如下:
[0020]嗜酸乳酸桿菌種子液按5%接種量接種至亞油酸含量為0.2mg/mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)，37°C下靜置培養(yǎng)20?24h ;培養(yǎng)液冷凍離心，離心條件為4000?5000rpm、20?30min、4°C;去上清液，沉淀嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞用無菌生理鹽水洗滌2?3次，離心收集嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞。
[0021]將裝有多孔陶粒的反應(yīng)容器滅菌后，加入離心收集到的嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞，嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞的濕重與多孔陶粒干重的比值為(I?1.5): (10?15);然后加入多孔陶粒重量I?1.5倍的生理鹽水浸沒載體和嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞；反應(yīng)容器置于4°C，靜置吸附
2.5小時(shí)，4°C、4000?5000rpm、離心5?lOmin，棄上清液，沉淀物即為吸附固化的嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞。
[0022]優(yōu)選地，嗜酸乳酸桿菌的種子液由以下方法制備:從新鮮斜面挑取活化的嗜酸乳酸桿菌接到MRS液體培養(yǎng)基中，37 0C，靜置培養(yǎng)24?30h，得種子液。
[0023]優(yōu)選地，每升MRS液體培養(yǎng)基中，各組分的用量為:酪蛋白胨10.0?15.0g、牛肉浸膏8.0?12.0g、酵母提取物3.0-6.0g、葡萄糖10.0?15.0g、乙酸鈉4.0?6.0g、梓檬酸二胺1.0?3.0g、吐溫-80 0.8?1.2g、磷酸氫二鉀1.0?3.0g、硫酸鎂0.1?0.3g、硫酸錳0.03?0.06g，余量為水。稱取前述各組分，置于2000ml燒杯內(nèi)，加雙蒸水至1000ml，加熱，攪拌，直至各組分完全溶解，磷酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 6.3?6.8，121°C高壓濕熱滅菌20-30min，即得MRS液體培養(yǎng)基。
[0024]優(yōu)選地，種子液接種量為5 %，種子液接種至亞油酸含量為0.12mg/mL MRS液體培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)；培養(yǎng)液冷凍離心的轉(zhuǎn)速是4000rpm，離心時(shí)間是24min。
[0025]優(yōu)選地，嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞的濕重與多孔陶粒干重的比值為12: 125;生理鹽水用量為多孔陶粒等重量；吸附后的離心轉(zhuǎn)速為4000rpm，離心時(shí)間為7min。
[0026]進(jìn)一步優(yōu)選地，種子液制備過程中，靜置培養(yǎng)時(shí)間為27h。
[0027]進(jìn)一步優(yōu)選地，每升MRS液體培養(yǎng)基中，各組分的用量為:酪蛋白胨12.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母提取物4.5g、葡萄糖12.0g、乙酸鈉5.0g、梓檬酸二胺2.0g、吐溫-80 1.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g，余量為水。稱取前述各組分，置于2000ml燒杯內(nèi)，加雙蒸水至1000ml，加熱，攪拌至各組分完全溶解，磷酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，121°C高壓濕熱滅菌25min，即得MRS液體培養(yǎng)基。
[0028]其中，步驟(3)中，紅花籽油介質(zhì)液由如下步驟