制備:
[0029]稱取10?15重量份的吐溫-80和5?10重量份的司盤-80，混勻，60_80°C水浴3-5min，再加入12?18重量份的紅花籽油，加入去離子水，形成油包水型乳化液，至紅花籽油終濃度為70-80mg/mL ;超聲乳化處理，處理?xiàng)l件為300?400W、5?7S、間歇3?5S，重復(fù)7?9次，形成穩(wěn)定的乳濁液，121°C高壓濕熱滅菌20-30min，即得紅花籽油乳化液，4°C保存?zhèn)溆谩?br>[0030]取0.lmol/L pH6.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，加入紅花籽油乳化液至紅花籽油終濃度為7?8mg/mL，加入豬胰脂肪酶2?4mg/30mL，備用。
[0031]優(yōu)選地，吐溫-80:司盤-80:紅花籽油的重量配比為12: 7: 12 ;紅花籽油終濃度為7.5mg/mL ;豬胰脂肪酶加入量為3mg/30mL。
[0032]其中，步驟⑷中，轉(zhuǎn)化方法為:
[0033]反應(yīng)容器中依次加入吸附固化的嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞、紅花籽油介質(zhì)液，嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞與紅花籽油介質(zhì)液的重量體積比為(I?1.5): (25?35)g/ml，加入生物素，生物素與紅花籽油介質(zhì)液的重量體積比為(3?6): (25?35)mg/ml，混勻，將反應(yīng)容器置于36°C下，轉(zhuǎn)速為100?150rpm，轉(zhuǎn)化反應(yīng)20?30h ;轉(zhuǎn)化結(jié)束后，4°C、4000?5000rpm、離心10?20min，上清液即轉(zhuǎn)化液；轉(zhuǎn)移出上清液進(jìn)行CLA的提取，然后在該反應(yīng)容器內(nèi)加入新鮮的紅花籽油介質(zhì)液，混勻，繼續(xù)進(jìn)行下一批次的轉(zhuǎn)化。實(shí)際小規(guī)模反應(yīng)常用50ml離心管作為反應(yīng)容器。
[0034]優(yōu)選地，嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞與紅花籽油介質(zhì)液的重量體積比為1.2g: 27ml;生物素與紅花籽油介質(zhì)液的重量體積比為4mg: 27ml。
[0035]在實(shí)際生產(chǎn)過程中，上述各步驟每種物質(zhì)的用量可以根據(jù)需要按比例擴(kuò)大或縮小。
[0036]共軛亞油酸的提取常用正己烷萃取，以5ml轉(zhuǎn)化液的提取為例:取5ml轉(zhuǎn)化液放入60ml梨形分液漏斗中，加入20ml正己燒，震蕩混合5min，靜置至完全分層后棄去下層水相液體，保留正己烷層和乳化層，加入5ml蒸餾水，混勻lmin，洗掉水溶性物質(zhì)，靜置分層，棄掉下層水相，然后把剩下的有機(jī)相和乳化層使用裝有無水硫酸鈉的濾紙過濾、吸水干燥，定容于25ml容量瓶中，搖勻后待測。
[0037]共軛亞油酸在232-234nm的紫外區(qū)有特征吸收，而亞油酸沒有，故常在233nm波長下檢測共軛亞油酸的含量。該方法以正己烷為溶劑，配制一系列濃度的共軛亞油酸，以正己燒為參比溶液，在233nm處測其吸光度值，以共軛亞油酸的濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算發(fā)酵液中CLA的含量。發(fā)酵前經(jīng)氣相色譜法測得紅花籽油含LA為81 %，根據(jù)下列公式計(jì)算LA的轉(zhuǎn)化率:LA轉(zhuǎn)化率=(生成CLA的量/紅花籽油中含有LA的量)*100%。
[0038]與現(xiàn)有的技術(shù)相比，本發(fā)明制備共軛亞油酸具有以下幾個(gè)優(yōu)點(diǎn):
[0039](I)本發(fā)明以來源廣泛的紅花籽油為原料，價(jià)格比亞油酸低廉，而且是各類植物油中亞油酸含量是最高的，約72-85%，這些亞油酸在乳酸菌亞油酸異構(gòu)酶的作用下可轉(zhuǎn)化生成附加值極高的CLA。
[0040](2)選用生物素作為嗜酸乳酸桿菌靜息細(xì)胞透性化處理，生物素不僅是一種良好的抗氧化劑，同時(shí)又可以增加細(xì)胞通透性，且簡單容易操作；選用合適添加量的生物素，能明顯提高轉(zhuǎn)化效率。
[0041](3)將透性化的嗜酸乳酸桿菌細(xì)胞采用離心吸附法固定在多空陶粒表面，以便該細(xì)胞態(tài)亞油酸異構(gòu)酶能多批次地用于CLA的合成，離心吸附固定技術(shù)解決了包埋固定化方法存在物質(zhì)交換的障礙和操作頻繁的難題，同時(shí)克服了吸附固定化方法吸附量小，細(xì)胞容易脫落的特點(diǎn)，達(dá)到高密度、多批次轉(zhuǎn)化的目的。
【附圖說明】
[0042]圖1共軛亞油酸的紫外標(biāo)準(zhǔn)曲線
[0043]圖2嗜酸乳酸菌細(xì)胞連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化合成CLA的轉(zhuǎn)化率
【具體實(shí)施方式】
[0044]實(shí)施例1:嗜酸乳酸菌細(xì)胞連續(xù)多批次轉(zhuǎn)化合成CLA的效率研究
[0045]1.1試驗(yàn)方法:
[0046](I)培養(yǎng)基的配制
[0047]MRS培養(yǎng)基主要包括液體MRS培養(yǎng)基和固體MRS培養(yǎng)基。
[0048]MRS液體培養(yǎng)基的制備:酪蛋白胨12.0g、牛肉浸膏10.0g、酵母提取物4.5g、葡萄糖12.0g、乙酸鈉5.0g、檸檬酸二胺2.0g、吐溫-80 1.0g、磷酸氫二鉀2.0g、硫酸鎂0.2g、硫酸錳0.05g，將上述藥品稱量好放在2000ml燒杯內(nèi)，加雙蒸水至1000ml，在電子萬用爐上加熱，用玻璃棒攪拌直至藥品全部溶解，液體呈透明的棕黃色時(shí)停止，用磷酸鈉緩沖溶液調(diào)節(jié)pH 6.5，121 °C高壓濕熱滅菌25min。
[0049]固體MRS培養(yǎng)基的配制方法是在上述基礎(chǔ)上，再加入12.0g瓊脂。
[0050](2)吸附載體的制備
[0051]多孔陶粒，直徑2?4臟，先用1.0moI/L鹽酸溶液浸泡12h，再用1.0moI/L氫氧化鈉溶液浸泡12h，水洗至中性，烘干備用。
[0052]多孔陶粒參考鮑騰等的研究方法制備(鮑騰；陳冬；陳天虎等.鐵氧化物生物多孔陶粒的制備工藝及性能，復(fù)合材料學(xué)報(bào)，2014年第2期.)。
[0053](3)紅花籽油的乳化液的制備
[0054]稱取1.2g吐溫-80和0.7g司盤-80，混勻，然后70°C水浴4min，再加入1.5g紅花籽油，逐漸滴加去離子水，形成油包水型乳化液，至紅花籽油終濃度為75mg/mL。超聲乳化處理(300W，超聲6S，間歇6S，重復(fù)8次)，形成穩(wěn)定的乳濁液，121 °C高壓濕熱滅菌24min，4°C
保存?zhèn)溆谩?br>[0055](4)紅花籽油介質(zhì)液的制備
[0056]取0.lmol/L pH6.5檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液，加入紅花籽油乳化液至紅花籽油終濃度為7.5mg/mL，加入豬胰脂肪酶3mg/30mL，備用。
[0057](5)乳酸菌細(xì)胞的收集
[0058]從新鮮斜面挑取一環(huán)活化菌種接到250mL MRS培養(yǎng)基中，37 °C下靜置培養(yǎng)27h，即為種子液。按5%接種量接種至亞油酸含量為0.2mg/mL MRS培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖誘導(dǎo)培養(yǎng)，37°C下靜置培養(yǎng)27h。培養(yǎng)液冷凍離心(4000rpm，離心時(shí)間24min，4°C )，去上清液，沉淀細(xì)胞用無菌生理鹽水洗滌2次，離心收集細(xì)胞。
[0059](6)乳酸菌細(xì)胞的離心吸附固定
[0060]將滅完菌裝有12.5g多孔陶粒的50ml離心管放置離心管架上，每支管中加入濕重
1.2g乳酸菌細(xì)胞，然后加入15ml生理鹽水浸沒載體和細(xì)胞，在4°C冰箱中靜置吸附2.5小時(shí)，離心(4000rpm，離心時(shí)間7min，4°C )，吸出上清液，沉淀物即為吸附固化的乳酸菌細(xì)胞。
[0061](7)固化乳酸菌細(xì)胞連續(xù)批次轉(zhuǎn)化紅花籽油生成共軛亞油酸
[0062]在有固定化乳酸菌的沉淀物離心管中加入27ml紅花籽油介質(zhì)液，加入4.5mg生物素透性化處理與轉(zhuǎn)化同步進(jìn)行，混勻，將離心管置于36°C下，轉(zhuǎn)速為120rpm，轉(zhuǎn)化反應(yīng)24h。轉(zhuǎn)化結(jié)束后，取出離心管放入離心機(jī)(4000rpm，離心時(shí)間15min，4°C )離心。上清液即轉(zhuǎn)化液，傾出可進(jìn)行CLA的提取，然后在該離心管內(nèi)加入新鮮的紅花籽油介質(zhì)液，混勻，繼續(xù)進(jìn)行下一個(gè)批次的轉(zhuǎn)化。
[0063](8)共軛亞油酸的提取
[0064]取5ml轉(zhuǎn)化液放入60ml梨形分液漏斗中，加入20ml正己燒，震蕩混合5min，靜置至完全分層后棄去下層水相液體，保留正己燒層和乳化層，加入5ml蒸饋水，混勾lmin，洗掉水溶性物質(zhì)，靜置分層，棄掉下層水相，然后把剩下的有機(jī)相和乳化層使用裝有無水硫酸鈉的濾