人源化的t細(xì)胞共受體的小鼠的制作方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】人源化的T細(xì)胞共受體的小鼠
[0001] 巧關(guān)申請(qǐng)的香叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求根據(jù)35U.S.C. § 119(e)的2013年10月15日提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申 請(qǐng)序列號(hào)61/890, 915和2013年2月20提交的美國(guó)臨時(shí)專(zhuān)利申請(qǐng)序列號(hào)61/766, 762的優(yōu) 先權(quán)，其全部?jī)?nèi)容在此參考并入。
[0003] 序列表
[0004] 本申請(qǐng)的說(shuō)明書(shū)中引用了W電子形式于2014年2月20日提交的序列表，其為文 件名為"2010794-0441_ST25"的ascii,txt文件。該.txt文件于2014年2月13日生成， 其大小為47化。 發(fā)明領(lǐng)域
[0005] 本發(fā)明設(shè)及非人動(dòng)物（例如，曬齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠），所述非人動(dòng)物經(jīng)基因 工程改造W表達(dá)人源化的T細(xì)胞共受體。本發(fā)明設(shè)及經(jīng)基因工程改造W表達(dá)人源化的CD4 或CD8共受體的非人動(dòng)物，W及表達(dá)其的胚胎、組織和細(xì)胞。本發(fā)明還設(shè)及經(jīng)工程改造W共 表達(dá)人源化的CD4共受體和人源化的主要組織相容性復(fù)合物（MHC)II的非人動(dòng)物。本發(fā)明 還設(shè)及經(jīng)工程改造W共表達(dá)人源化的CD8共受體和人源化的血ICI的非人動(dòng)物。本發(fā)明還 提供了制備經(jīng)基因工程改造的動(dòng)物的方法，所述動(dòng)物表達(dá)人源化的T細(xì)胞共受體（例如，人 源化的CD4或CD8)。本發(fā)明還提供了使用表達(dá)人源化的T細(xì)胞共受體的所述經(jīng)基因工程改 造的動(dòng)物用于研發(fā)人類(lèi)療劑的方法。
[0006] 發(fā)巧背景
[0007] 在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中，外來(lái)抗原被B淋己細(xì)胞和T淋己細(xì)胞上的受體分子（例如， 免疫球蛋白和T細(xì)胞受體或TCR)所識(shí)別。運(yùn)些外來(lái)抗原被特定蛋白作為膚片段遞呈至細(xì) 胞表面上，通常將所述特定蛋白稱(chēng)為主要組織相容性復(fù)合物（MHC)分子。在T細(xì)胞介導(dǎo)的 應(yīng)答過(guò)程中，由MHC分子遞呈的抗原被T細(xì)胞受體所識(shí)別。然而，有效的免疫應(yīng)答除了需要 MHC-抗原復(fù)合物的T細(xì)胞受體識(shí)別W外，還需要T細(xì)胞共受體分子（例如，CD4或CD8)與 MHC恒定部分的結(jié)合。
[0008] T細(xì)胞分為幾個(gè)種類(lèi)，包括輔助T細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞。輔助T細(xì)胞表達(dá)共受 體CD4并且識(shí)別與MHCII分子結(jié)合的抗原。CD4+T細(xì)胞活化免疫系統(tǒng)中的其他效應(yīng)細(xì)胞， 例如活化表達(dá)MHCII的B細(xì)胞W產(chǎn)生抗體，活化表達(dá)MHCII的巨隧細(xì)胞W破壞病原體等。 CD4和T細(xì)胞受體與相同MHCII遞呈的外來(lái)抗原的結(jié)合使得T細(xì)胞對(duì)該抗原具有更加顯著 的敏感性。
[0009] 而相反的是，細(xì)胞毒性T細(xì)胞（CTL)表達(dá)共受體CD8并且識(shí)別與MHCI分子結(jié)合 的外來(lái)抗原。CTL專(zhuān)口地殺傷攜帶被其自身膜結(jié)合TCR所識(shí)別的MHCI結(jié)合膚的任意細(xì)胞。 當(dāng)細(xì)胞展示出來(lái)源于非正常存在的（例如，來(lái)源于病毒、腫瘤或其他非自身來(lái)源）細(xì)胞蛋白 的膚時(shí)，此類(lèi)膚被CTL所識(shí)別，CTL被活化并且殺傷展示出所述膚的細(xì)胞。與CD4類(lèi)似，CD8 的結(jié)合使得CTL對(duì)MHCI遞呈的抗原更加敏感。
[0010] 由于耐受機(jī)制使得并非所有的抗原均激發(fā)T細(xì)胞活化。然而，在一些疾病中（例 如，癌癥、自身免疫性疾?。﹣?lái)源于自身蛋白的膚成為免疫系統(tǒng)細(xì)胞成分的祀點(diǎn)，運(yùn)導(dǎo)致遞 呈此類(lèi)膚的細(xì)胞被破壞。其對(duì)于識(shí)別具有臨床意義的抗原（例如，與多種類(lèi)型的癌癥相關(guān) 的抗原）方面具有顯著的推動(dòng)作用。然而，為了改進(jìn)對(duì)在人類(lèi)T細(xì)胞中激發(fā)適宜應(yīng)答的膚的 鑒定和選擇，特別是具有臨床意義的抗原的膚，仍需要模擬人免疫系統(tǒng)的體內(nèi)和體外系統(tǒng)。 因此，需要能夠展示出人免疫系統(tǒng)成分的生物系統(tǒng)（例如，基因修飾的非人動(dòng)物和細(xì)胞）。
[0011] 發(fā)巧概沐
[0012] 本申請(qǐng)?zhí)峁┝税侨思?xì)胞的非人動(dòng)物，所述非人細(xì)胞表達(dá)在細(xì)胞免疫應(yīng)答中具 有功能的人的或人源化的分子。本申請(qǐng)還提供了編碼人或人源化的T細(xì)胞共受體（例如， CD4和/或CD8)蛋白的人源化的曬齒動(dòng)物基因座。本申請(qǐng)還提供了表達(dá)人或人源化的T細(xì) 胞共受體（例如，CD4和/或CD8)蛋白的人源化的曬齒動(dòng)物細(xì)胞。本申請(qǐng)?zhí)峁┝梭w內(nèi)和體 外系統(tǒng)，所述系統(tǒng)包含人源化的曬齒動(dòng)物細(xì)胞，其中所述曬齒動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)一種或多種人 或人源化的免疫系統(tǒng)分子。
[0013] 本申請(qǐng)?zhí)峁┮环N基因修飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物在其基因組中包含編碼人或 人源化的T細(xì)胞共受體多膚的核巧酸序列。在不同實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修 飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物包含編碼嵌合的人/非人T細(xì)胞共受體多膚的核巧酸序列。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核巧酸序列存在于內(nèi)源性T細(xì)胞共受體基因座。在一個(gè)實(shí)施方式 中，所述嵌合的T細(xì)胞共受體多膚的人部分包含全部或基本上全部的人T細(xì)胞共受體的胞 外域，和所述非人動(dòng)物表達(dá)功能性的嵌合的T細(xì)胞共受體多膚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌 合的T細(xì)胞共受體多膚的非人部分至少包含非人T細(xì)胞共受體的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和所 述非人動(dòng)物表達(dá)功能性的嵌合的T細(xì)胞共受體多膚。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述嵌合的T 細(xì)胞共受體多膚僅在所述非人動(dòng)物的T細(xì)胞上表達(dá)，例如其不在所述非人動(dòng)物的B細(xì)胞上 表達(dá)。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物不表達(dá)來(lái)自其內(nèi)源性非人T細(xì)胞共受體基因座的功能性非人T 細(xì)胞共受體。在本發(fā)明的一個(gè)方面，所述嵌合的T細(xì)胞共受體多膚包含在所述非人動(dòng)物的 種系中。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物在內(nèi)源性T細(xì)胞共受體基因座包含編碼所述嵌合的T細(xì)胞 共受體多膚的核巧酸序列的一個(gè)或兩個(gè)拷貝；因此，所述動(dòng)物針對(duì)編碼嵌合的T細(xì)胞共受 體多膚的所述核巧酸序列可W是雜合的或純合的。
[0014] 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞共受體是CD4。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了一 種基因修飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物包含編碼嵌合的人/或非人CD4多膚的核巧酸序列。 在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核巧酸序列存在于內(nèi)源性CD4基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng) 物是曬齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，本發(fā)明提供了一種基因修飾的 小鼠，所述小鼠在其內(nèi)源性CD4基因座包含編碼嵌合的人/小鼠CD4多膚的核巧酸序列，其 中所述嵌合的CD4多膚的人源部分包含全部或基本上全部的人CD4多膚的胞外域，其中所 述嵌合的CD4多膚的小鼠部分至少包含小鼠CD4多膚的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和其中所述小 鼠表達(dá)功能性的嵌合的人/小鼠CD4。在一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的小 鼠，所述小鼠在其內(nèi)源性CD4基因座包含編碼嵌合的人/小鼠CD4多膚的核巧酸序列，其中 所述嵌合的多膚的人源部分至少包含全部或基本上全部的人CD4多膚的結(jié)構(gòu)域D1-D3,其 中所述嵌合的多膚的小鼠部分至少包含小鼠CD4的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和其中所述小鼠表 達(dá)功能性的嵌合的人/小鼠CD4。在一個(gè)方面，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自其內(nèi)源性小鼠CD4基因 座的功能性?xún)?nèi)源性小鼠CD4。在一個(gè)實(shí)施方式中，編碼嵌合的人/小鼠CD4多膚的所述核巧 酸序列與內(nèi)源性小鼠啟動(dòng)子和調(diào)控序列可操作地連接。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠 在CD8譜系的B細(xì)胞或T細(xì)胞上不表達(dá)所述嵌合的CD4蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌 合的CD4蛋白的人源部分包含如SEQIDN0:57所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述嵌合的人/小鼠CD4多膚如SEQIDNO:4所示。
[0015] 在一個(gè)方面，包含本申請(qǐng)所述的嵌合的CD4多膚的所述基因修飾的非人動(dòng)物，例 如所述基因修飾的小鼠，還包含人或人源化的MHCII蛋白，其中所述MHCII蛋白包含人 MHCIIa多膚的胞外域和人MHCII0多膚的胞外域。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含人源 化的MHCII蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是小鼠并且所述小鼠在內(nèi)源性MHCII基 因座包含（1)編碼嵌合的人/小鼠MHCIIa多膚的核巧酸序列，其中所述MHCIIa多 膚的人源部分包含人MHCIIa的胞外域，和內(nèi)源性小鼠MHCIIa多膚的跨膜和胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域，化及似編碼嵌合的人/小鼠MHCII0多膚的核巧酸序列，其中所述MHCII0多 膚的人源部分包含人MHCII0的胞外域，和內(nèi)源性小鼠MHCII0多膚的跨膜和胞質(zhì)結(jié) 構(gòu)域。對(duì)包含編碼嵌合的人/非人（例如人/小鼠）MHCII核巧酸序列的基因修飾的非人 動(dòng)物（例如小鼠）更加詳細(xì)的描述請(qǐng)參見(jiàn)美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3/661，116和13/793, 935,其 通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。在一個(gè)實(shí)施方式中，表達(dá)人源化的CD4和/或MHCII蛋白的動(dòng) 物通過(guò)取代分別位于CD4和/或MHCII基因座的內(nèi)源性非人（例如小鼠）CD4和/或MHC II基因的部分產(chǎn)生。
[0016] 因此，本申請(qǐng)還提供了一種修飾非人動(dòng)物（例如曬齒動(dòng)物，例如小鼠）的CD4基因 座W表達(dá)嵌合的人/小鼠CD4多膚的方法，所述方法包括使用編碼嵌合的人/小鼠CD4多 膚的核巧酸序列在內(nèi)源性CD4基因座取代編碼內(nèi)源性非人（例如小鼠）CD4多膚的核巧酸 序列。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合的人/非人（例如人/曬齒動(dòng)物，例如人/小鼠）CD4 多膚包含至少全部或基本上全部的人CD4多膚的結(jié)構(gòu)域D1-D3和內(nèi)源性非人（例如曬齒動(dòng) 物，例如小鼠）CD4多膚的至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所表達(dá)的嵌合的人 /小鼠CD4如沈QIDN0:4所示。
[0017] 在另一個(gè)實(shí)施方式中，所述T細(xì)胞共受體是CD8。因此，在一個(gè)方面，本發(fā)明提供了 一種基因修飾的非人動(dòng)物，所述非人動(dòng)物包含編碼嵌合的人/非人CD8多膚的核巧酸序列， 例如嵌合的人/非人CDSa和/或CD80多膚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述核巧酸序列位于 內(nèi)源性CD8基因座。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述動(dòng)物是曬齒動(dòng)物，例如小鼠或大鼠。因此，在 一個(gè)實(shí)施方式中，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N基因修飾的小鼠，所述小鼠在其內(nèi)源性CD8基因座（例 如內(nèi)源性CD8a和/或CD8 0基因座）包含編碼嵌合的人/小鼠CD8a多膚的第一核巧酸 序列和編碼嵌合的人/小鼠CD8 0多膚的第二核巧酸序列，其中所述第一核巧酸序列包含 編碼全部或基本上全部的人CDSa多膚的胞外域和小鼠CDSa多膚至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域 的序列，和其中所述第二核巧酸序列包含編碼全部或基本上全部的人CD8 0多膚的胞外域 和小鼠CD80多膚至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的序列，其中所述小鼠表達(dá)功能性的嵌合的人/ 小鼠CD8蛋白。在一個(gè)方面，所述小鼠不表達(dá)來(lái)自其內(nèi)源性小鼠CD8基因座的功能性的內(nèi) 源性的小鼠CD8多膚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述第一核巧酸序列與內(nèi)源性小鼠CDSa啟動(dòng) 子和調(diào)控序列可操作地連接，和所述第二核巧酸序列與內(nèi)源性小鼠CD80啟動(dòng)子和調(diào)控序 列可操作地連接。因此，在一個(gè)實(shí)施方式中，所述小鼠在CD4譜系的B細(xì)胞或T細(xì)胞上不表 達(dá)嵌合的CD8蛋白。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合的CDSa和/或0多膚的人源部分包含 人CD8a和/或e多膚的免疫球蛋白V-樣結(jié)構(gòu)域。在一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合的人/ 小鼠CDSa多膚的人源部分包含如SEQIDNO: 59所示的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述嵌合的人/小鼠CD8 0多膚的人源部分包含如SEQIDNO:58所示的氨基酸序列。在 一個(gè)實(shí)施方式中，所述嵌合的人/小鼠CDSa多膚如SEQIDN0:54所示，和所述嵌合的人 /小鼠CD8 0多膚如沈QIDNO:53所示。
[0018] 在一個(gè)方面，包含本申請(qǐng)所述的嵌合的CDSa和/或0多膚的基因修飾的非人動(dòng) 物（例如基因修飾的小鼠）還包含人或人源化的MHCI蛋白，其中所述MHCI蛋白包含人 MHCI多膚的胞外域。在一個(gè)方面，所述動(dòng)物包含人源化的MHCI復(fù)合物。因此，所述動(dòng)物 可W包含人源化的MHCI蛋白和人或人源化的02微球蛋白多膚。在一個(gè)實(shí)施方式中，所 述動(dòng)物是小鼠和所述小鼠在內(nèi)源性MHCI基因座包含編碼嵌合的人/小鼠MHCI多膚的核 巧酸序列，其中所述MHCI多膚的人源部分包含人MHCI多膚的胞外域，和內(nèi)源性小鼠MHC I多膚的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域；和所述動(dòng)物在內(nèi)源性P2微球蛋白基因座還包含編碼人或人 源化的0 2微球蛋白的核巧酸序列。對(duì)包含編碼嵌合的人/非人（例如人/小鼠）MHCI 和02微球蛋白的核巧酸序列的基因修飾的非人動(dòng)物（例如小鼠）更加詳細(xì)的描述請(qǐng)參見(jiàn) 美國(guó)專(zhuān)利申請(qǐng)?zhí)?3/661，159和13/793,812,其通過(guò)引用整體并入本申請(qǐng)。在一個(gè)實(shí)施方 式中，表達(dá)人源化的CD8、MHCI和/或0 2微球蛋白的動(dòng)物通過(guò)取代分別位于CD8、MHCI 和/或0 2微球蛋白基因座的內(nèi)源性非人（例如小鼠）CD8、MHCI和/或0 2微球蛋白基 因的部分產(chǎn)生。
[0019] 因此，本申請(qǐng)還提供了一種修飾非人動(dòng)物（例如曬齒動(dòng)物，例如小鼠）的CD8基因 座W表達(dá)嵌合的人/小鼠CD8多膚的方法，所述方法包括使用編碼嵌合的人/小鼠CD8多膚 的核巧酸序列取代在內(nèi)源性CD8基因座的編碼內(nèi)源性非人（例如小鼠）CD8多膚的核巧酸 序列。在一個(gè)方面，所述CD8多膚選自下組：CD8a、CD8 0及其組合。在一個(gè)實(shí)施方式中， 所述嵌合的人/非人（例如人/曬齒動(dòng)物，例如人/小鼠）CD8多膚（CD8a和/或CD8 0 ) 包含全部或基本上全部的人CD8多膚的胞外域和內(nèi)源性非人（例如曬齒動(dòng)物，例如小鼠） CD8多膚的至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。
[0020] 本申請(qǐng)還提供了來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物（例如曬齒動(dòng)物，例如小鼠或大 鼠）的細(xì)胞，例如T細(xì)胞。本申請(qǐng)還提供了來(lái)源于本申請(qǐng)所述的非人動(dòng)物的組織和胚胎。
[0021] 除非另有明示或者從上下文中是顯而易見(jiàn)的，本申請(qǐng)所述的任意實(shí)施方式和方面 均可W用于彼此之間組合。通過(guò)對(duì)隨后詳細(xì)描述的回顧，其他實(shí)施方式對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員 將是顯而易見(jiàn)的。下述的詳細(xì)描述包括對(duì)本發(fā)明不同實(shí)施方式的示例性表述，其對(duì)所主張 本發(fā)明不具有限制作用。附圖構(gòu)成本說(shuō)明書(shū)的一部分，其與該描述一起，僅用于說(shuō)明實(shí)施方 式，并非用于限制本發(fā)明。 陽(yáng)0。] 附圖簡(jiǎn)沐
[0023] 圖1是產(chǎn)生人源化CD4基因座策略的示意圖（未按照比例）。首先，緊隨信號(hào)膚之 后的小鼠外顯子3-6的序列被所述信號(hào)膚下游的人外顯子3序列所取代（上圖），隨后通過(guò) 限制性消化/連接將人外顯子4-6插入人外顯子3下游。 W24] 圖2顯示了使用抗-人CD4和抗-小鼠CD4抗體對(duì)來(lái)源于WT小鼠或針對(duì)人CD4 的小鼠雜合子（1766肥T)的脾細(xì)胞進(jìn)行的FACS分析（A);和對(duì)來(lái)源于WT小鼠VS.1766肥T 小鼠VS.化rkat人CD4T細(xì)胞系的T細(xì)胞進(jìn)行的FACS分析。 陽(yáng)O巧]圖3是通過(guò)使用人CD8 0外顯子2-3取代小鼠CD8 0外顯子2-3產(chǎn)生人源化CDSb基因座（MAID1737)策略的示意圖（未按照比例）。小鼠外顯子序列W實(shí)屯、矩形表示，人外 顯子序列W散列矩形表示。
[0026] 圖4是通過(guò)使用人外顯子2-3取代小鼠外顯子1的一部分和外顯子2,保留在外顯 子1起始的小鼠先導(dǎo)序列產(chǎn)生人源化CDSa基因座（MAID1738)策略的示意圖（未按照比 例）。小鼠外顯子序列W實(shí)屯、矩形表示，人外顯子序列W散列矩形表示。
[0027] 圖5是產(chǎn)生包含編碼人源化的CDSb和CDSa基因序列的人源化基因座的順序祀向 策略的示意圖（未按照比例）。小鼠外顯子序列W實(shí)屯、矩形表示，人外顯子序列W散列矩形 表不。
[0028] 圖6是使用小鼠CD8b、小鼠CD8a、人CDSb或人CDSa抗體對(duì)來(lái)自于WT小鼠或已除 去選擇性表達(dá)盒的針對(duì)人CDSb和CDSa的雜合子小鼠（1739化t，174(met)的脾細(xì)胞進(jìn)行的 FACS分析。 W29] 圖7是使用小鼠CDSb、小鼠CDSa、人CDSb、人CDSa或CD4對(duì)來(lái)自于WT小鼠或 1739肥T/1740肥T小鼠（針對(duì)CDSb和CDSa的雜合子小鼠）的胸腺細(xì)胞進(jìn)行的FACS分析。 [0030]發(fā)巧詳沐 W川定義
[0032] 本發(fā)明提供了表達(dá)人源化的T細(xì)胞共受體多膚的基因修飾的非人動(dòng)物（例如小 鼠、大鼠、家兔等）；包含其的胚胎、細(xì)胞和組織；制備其的方法；W及使用其的方法。除非另 有定義，本申請(qǐng)中使用的所有術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)包括所述術(shù)語(yǔ)和短語(yǔ)在現(xiàn)有技術(shù)中已有的含義， 除非存在相反的明確指示或從該術(shù)語(yǔ)或短語(yǔ)使用的上下文中是顯而易見(jiàn)的。
[0033] 術(shù)語(yǔ)"保守的"當(dāng)用于描述保守的氨基酸取代時(shí)，包括氨基酸殘基被帶有具有相似 化學(xué)性質(zhì)（例如電荷或疏水性）的側(cè)鏈R基團(tuán)的其他氨基酸殘基取代?？蒞通過(guò)修飾核 巧酸序列實(shí)現(xiàn)保守的氨基酸取代，W引入編碼保守的取代的核巧酸改變。在通常情況下，保 守的氨基酸取代將基本上不改變目的蛋白的功能性性質(zhì)，例如CD4或CD8分別與MHCII或 I結(jié)合的能力，并且增加TCR對(duì)血IC提呈的抗原的敏感性。帶有具有相似化學(xué)性質(zhì)的 側(cè)鏈的氨基酸基團(tuán)的示例包括脂肪族側(cè)鏈如甘氨酸、丙氨酸、鄉(xiāng)氨酸、亮氨酸和異亮氨酸； 脂肪族-徑基側(cè)鏈如絲氨酸和蘇氨酸；含有酷胺的側(cè)鏈如天冬酷胺和谷氨酷胺；芳香側(cè)鏈 如苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；堿性側(cè)鏈如賴(lài)氨酸、精氨酸和組氨酸；酸性側(cè)鏈如天冬氨酸 和谷氨酸；W及含硫側(cè)鏈如半脫氨酸和甲硫氨酸。保守的氨基酸取代基團(tuán)包括例如鄉(xiāng)氨酸 /亮氨酸/異亮氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸、賴(lài)氨酸/精氨酸、丙氨酸/鄉(xiāng)氨酸、谷氨酸/天 冬氨酸和天冬酷胺/谷氨酷胺。在一些實(shí)施方式中，保守的氨基酸取代可W是使用丙氨酸 取代蛋白中的任意天然殘基，如用在例如丙氨酸掃描誘變中。在一些實(shí)施方式中，Gonnet 等（（1992)ExhaustiveMatchingoftheEntireProteinSequenceDatabase,Science 256:1443-45)披露保守的氨基酸取代使得在PAM2501og-似然性矩陣中具有正值，其通 過(guò)引用并入本申請(qǐng)。在一些實(shí)施方式中，所述取代是適度保守的取代，其中所述取代在 PAM2501og-似然性矩陣中具有非負(fù)值。
[0034] 因此，本發(fā)明還包括一種基因修飾的非人動(dòng)物，其基因組包含（例如在內(nèi)源性基 因座）編碼人源化的T細(xì)胞共受體多膚（例如CD4或CD8多膚）的核巧酸序列，其中所述 多膚包含本申請(qǐng)所述的氨基酸序列的保守的氨基酸取代。
[0035] 本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解除了編碼本申請(qǐng)所述的人源化的T細(xì)胞共受體多膚的核 酸殘基W外，由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，其他核酸可W編碼本發(fā)明的多膚。因此，除了在其基 因組中包含編碼具有保守的氨基酸取代的T細(xì)胞共受體多膚（例如CD4或CD8多膚）的核 巧酸序列的基因修飾的非人動(dòng)物W外，本申請(qǐng)還提供了由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性使其基因組 中包含不同于本申請(qǐng)所述核巧酸序列的非人動(dòng)物。
[0036] 術(shù)語(yǔ)"同一性"當(dāng)與序列結(jié)合使用時(shí)包括根據(jù)本領(lǐng)域公知的能夠用于測(cè)定核巧酸 和/或氨基酸序列同一性的多種不同算法確定的同一性。在本申請(qǐng)所述的一些實(shí)施方式 中，使用開(kāi)放缺口罰分為10. 0,延伸缺口罰分為0. 1的ClustalWV.1.83(slow)比對(duì)和使 用Gonnet相似性矩陣（MacVector?10. 0. 2,MacVectorInc. , 2008)確定同一性。針對(duì)序列 的同一性比較序列的長(zhǎng)度將取決于特定的序列。在不同實(shí)施方式中，通過(guò)從其N(xiāo)-末端至