其 C-末端比較成熟蛋白的序列確定其同一性。在不同實施方式中，當將嵌合的人/非人序列 與人序列進行比較時，將所述嵌合的人/非人序列的人部分（而不是非人部分）用于進行 針對確定人序列與嵌合的人/非人序列的人部分之間的同一性水平目的的比較（例如將嵌 合人/小鼠蛋白的人胞外域與人蛋白的人胞外域進行比較）。
[0037] 術(shù)語"同源性"或"同源的"設(shè)及序列例如核巧酸或氨基酸序列時指兩條序列根據(jù) 最佳比對和比較例如至少約75 %的核巧酸或氨基酸、例如至少約80 %的核巧酸或氨基酸、 例如至少約90-95%的核巧酸或氨基酸、例如超過97%的核巧酸或氨基酸是一致的。本領(lǐng) 域技術(shù)人員將理解對于最佳基因祀向所述祀向構(gòu)建體應(yīng)含有與內(nèi)源性DNA序列具有同源 性的臂r即同源臂"）；因此，同源重組可W發(fā)生在祀向構(gòu)建體與被祀向的內(nèi)源性序列之間。
[0038] 術(shù)語"可操作地連接"指并列的，其中運樣描述的所述組分與允許其W其意向的方 式發(fā)揮功能相關(guān)。正因如此，編碼蛋白的核酸序列可W與調(diào)控序列（例如，啟動子、增強子、 沉默子序列等）可操作地連接W保持正確的轉(zhuǎn)錄調(diào)控。此外，本發(fā)明的嵌合或人源化蛋白 的不同部分可W可操作地連接W保持合適的折疊、加工、祀向、表達，W及所述蛋白在細胞 中的其他功能性性質(zhì)。除非另有說明，本發(fā)明的嵌合或人源化蛋白的不同結(jié)構(gòu)域彼此之間 可操作地連接。
[0039] 術(shù)語"取代"設(shè)及基因取代時指在內(nèi)源性基因座放置外源性遺傳物質(zhì)，從而使用 直系同源或同源的核酸序列取代全部或部分內(nèi)源性基因。如下述實施例中所示，編碼小鼠 CD4或CD8 (CD8 a和/或CD8 0)多膚部分的內(nèi)源性基因座的核酸序列分別被編碼人CD4或 CD8(CD8a和/或CD8 0)多膚部分的核巧酸序列所取代。
[0040] 在本申請中使用的"功能性"例如設(shè)及功能性多膚時指與天然蛋白相關(guān)的至少一 種生物活性保留正常的多膚。例如，在本發(fā)明的一些實施方式中，在內(nèi)源性基因座的取代 (例如在內(nèi)源性非人CD4或CD8基因座的取代）使得在基因座中不能表達功能性的內(nèi)源性 多膚。 陽041] 本申請下文中描述的針對基因修飾的CD4非人動物的若干方面，例如動物類型； 動物品系；細胞類型；篩選、檢測和其他方法；使用方法等，將適用于基因工程改造的CD8動 物。
[0042] 基因修飾的CD4動物
[0043] 在不同實施方式中，本發(fā)明通常地提供了基因修飾的非人動物，所述非人動物在 其基因組例如在內(nèi)源性CD4基因座中包含編碼人源化的CD4多膚的核巧酸序列；因此所述 動物表達人源化的CD4多膚。 W44] 人CD4基因位于12號染色體，認為其含有10個外顯子。CD4基因編碼具有氨 基末端疏水性信號序列的蛋白，該信號序列由所述基因的外顯子2和3所編碼。所述蛋 白包含4個免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，通常稱為D1-D4結(jié)構(gòu)域。Maddon等，（1987)Struc化re andexpressionofthehumanandmouseT4genes(人和小鼠T4 基因的結(jié)構(gòu)和表 達），Proc.化tl.Acad.Sci.USA84:9155-59。據(jù)信Dl結(jié)構(gòu)域由外顯子3(信號膚的下游序 列）和外顯子4編碼，而D2、D3和D4分別由彼此獨立的外顯子--外顯子5、6和7編碼。 Littman(IgST)HieSt;ruc1:ureoftheCD4andCD8Genes(CD4 和CD8 基因的結(jié)構(gòu)），Ann. Rev.Immunol. 5:561-84 ;Hanna等，（1994)SpecificExpressionoftheHumanCD4Genein MstureCD4+CD8-曰ndImmtureCD4+CD8+Tcells曰ndinMscrophsgesofTransgenic Mice(人CD4基因在轉(zhuǎn)基因小鼠成熟的CD4+CD8-和未成熟的CD4+CD8巧細胞中和巨隧細 胞中的特異性表達），Mol.Cell.Biol. 14(2) :1084-94 ;Maddon等，如上所述。在所述蛋白 濃度較高的區(qū)域，如T細胞與抗原遞呈細胞之間相接觸的區(qū)域，分子趨向于通過反向D4 結(jié)構(gòu)域之間的相互作用形成同型二聚體。Zamoyska(1998)CD4andCD8:mo化IatorsofT cellreceptorrecognitionof曰ntigen曰ndofimmuneresponses? (CD4 和CD8:T 細胞受體識別抗原和免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)劑？）化rr.化in.Immunol. 10:82-87 ;Wu等，（1997) Dimeric曰ssoci曰tionandsegment曰Iv曰ri曰bilityinthestructureofhumanCD4(在 人CD4結(jié)構(gòu)中的二聚結(jié)合和區(qū)段可變性），化Uire387:527 ;Moldovan等，（2002)CD4Dimers ConstitutetheFunctionalComponentRequiredforTCellActivation(CD4二聚體構(gòu) 成T細胞活化所需的功能性成分），J.Immunol. 169:6261-68.
[0045]CD4的Dl結(jié)構(gòu)域類似于免疫球蛋白的可變（V)結(jié)構(gòu)域，其與D2結(jié)構(gòu)域的一部分 一起據(jù)信與MHCII結(jié)合。Huang等，（1997)AnalysisofthecontactsitesontheCD4 MoleculewithClassIIMHCMolecule(對CD4分子與II類MHC分子上的接觸位點的分 子），J.Immunol.158:216-25。反過來，MHCII與T細胞共受體CD4在MHCIIa2 和 02 結(jié) 構(gòu)域之間連接的疏水性裂隙上發(fā)生相互作用。Wang和Reinherz(2002)StructuralBasis ofTCellRecognitionofPeptidesBoundtoMHCMolecules(膚與MHC分子結(jié)合的T 細胞識別的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)），MolecularImmunology, 38:1039-49。
[0046]CD4共受體的D3和D4結(jié)構(gòu)域據(jù)信與TCR-CD3復(fù)合物相互作用，當運兩個結(jié)構(gòu)域被 取代時，CD4不能與TCR結(jié)合。Vi即ali等，（1996)TheTwoMembraneProximalDomainsof CD4InteractwiththeTCellRecepto;r(CD4與T細胞受體相互作用的兩個膜近端結(jié)構(gòu) 域），J.Exp.Med. 183:2097-2107。CD4分子W二聚體的形式存在，在該分子D4結(jié)構(gòu)域中的殘 基據(jù)信負責CD4 的二聚化。Moldovan等，（2002)CD4DimersConsti1:utetheF^mctional ComponentsRequiredforTCellActivation(CD4二聚體構(gòu)成T細胞活化所需的功能性 成分），J.Immunol. 169:6261-68。
[0047]CD4基因的外顯子8編碼跨膜結(jié)構(gòu)域，而該基因其余的部分編碼胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。CD4 的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有多種獨特的功能。例如，CD4的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域募集酪氨酸激酶Lck。Lck 是Src家族激酶，其與CD4和CD8胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合并且所述共受體和TCR同時與相同的 MHC結(jié)合導(dǎo)致CD3和TCR復(fù)合物C鏈酪氨酸憐酸化的增加，其反過來會導(dǎo)致在T細胞活 化中具有作用的其他因子的募集。Itano及其同事通過設(shè)計和檢測包含CD8胞外域和CD4 胞質(zhì)尾的雜交蛋白在轉(zhuǎn)基因小鼠中的表達提出CD4的胞質(zhì)尾也能夠促進CD4+CD8巧細 胞分化成CD4+譜系。Itano等，（1996)1116 切toplasmicDomainofCD4Promotesthe DevelopmentofCD4LineageTCells(CD4的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域促進CD4譜系T細胞的發(fā)育），J. Exp.Med. 183:731-41。所述雜交蛋白的表達導(dǎo)致M肥I特異性CD4譜系T細胞的發(fā)育。同 上。
[0048]CD4共受體似乎是HIV病毒的主要受體，而CD4巧細胞耗竭是疾病進展的指示劑。 CD4的胞質(zhì)尾似乎是在HIV誘導(dǎo)的調(diào)亡中將調(diào)亡信號傳送至CD4巧細胞所必需的。特別 地，CD4與Lck之間的相互作用顯示出在運些細胞中加強HIV誘導(dǎo)的調(diào)亡。Corbeil等， (1996)HIV-inducedApoptosisRequirestheCD4ReceptorCytoplasmicTailandIs AcceleratedbyInteractionofCD4withp561ck(}nV誘導(dǎo)的調(diào)亡需要CD4 受體胞質(zhì)尾 并且其被CD4與p561ck之間的相互作用所加速），J.Exp.Med. 183:39-48。
[0049]T細胞在胸腺中的發(fā)育過程為從不成熟的CD4-/CD8-(雙重陰性或DN)胸腺細胞變 成CD4+/CD8+ (雙重陽性或D巧胸腺細胞，其最終經(jīng)歷陽性選擇成為CD4+或CD8+ (單一陽性 或SP)T細胞。通過MHCI限制性TCR接收信號的DP胸腺細胞分化成CD8+T細胞，而通過 MHCII限制性TCR接收信號的DP胸腺細胞分化成CD4巧細胞。被DP細胞所接收而導(dǎo)致其 分化成CD4+或CD8巧細胞的信號已成為研究非常廣泛的主題。已提出了針對CD4/CD8譜 系選擇的多種模型，Singer等，（2008)Lineagefateandintensedebate:myths,models andmechanismsofCD4-versusCDS-Iineagechoice(譜系命運和激烈的爭論：CD4-對比 CD8-譜系選擇的猜測、模型和機制），化t.Rev.Immunol. 8:788-801.對其進行了綜述。
[0050] 陽性選擇導(dǎo)致的特定T細胞共受體的失活是轉(zhuǎn)錄調(diào)控的產(chǎn)物。對于CD4而言， 已發(fā)現(xiàn)其增強子位于CD4外顯子1上游13化處，其在CD4+和CD8巧細胞中上調(diào)CD4的 表達。Killeen等，(1993)RegulatedexpressionofhumanCD4rescueshelperT celldevelopmentinmiceI曰ekingexpressionofendogenousCD4,(人CD4 雙調(diào)控 的表達在缺乏內(nèi)源性CD4表達的小鼠中挽救輔助T細胞的發(fā)育化MBOJ. 12:1547-53。 位于鼠源性CD4基因的第一內(nèi)含子中的順式作用轉(zhuǎn)錄沉默子的功能為在CD4巧細胞W 外的細胞中沉默CD4 的表達。Siu等，（1994)Atranscriptionalsilencercontrol thedevelopmentalexpressionoftheCD4gene(轉(zhuǎn)錄沉默子控制CD4 基因的發(fā)育表 達），EMBOJ. 13:3570-3579。
[0051] 由于在此前研發(fā)的表達人CD4的轉(zhuǎn)基因小鼠的若干品系中控制CD4品系選擇的重 要轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子（例如，啟動子、增強子、沉默子等）缺失，使得運些小鼠不能進行正常的T細 胞譜系發(fā)育，并且產(chǎn)生表達CD4的CD4巧細胞W外的免疫細胞。參見例如，Law等，（1994) HumanCD4RestoresNormalTCellDevelopmentandFunctioninMiceDeficientin CD4 (人CD4使得CD4缺陷小鼠恢復(fù)正常的T細胞發(fā)育和功能），J.Exp.Med. 179:1233-42 (在 CD8巧細胞和B細胞中表達CD4) ;Rigger等，（1994化邱ressionofHLA-DR4andhumanCD4 transgenesinmicedeterminesthevariableregion0-chainT-cellrepertoire andmediatesanHLA-D-restrictedimmuneresponse化LA-DR4和人CD4轉(zhuǎn)基因在小鼠中 的表達決定可變區(qū)0 -鏈T-細胞庫和介導(dǎo)HLA-D-受限制的免疫應(yīng)答），Proc.化tl.Acad. Sci.USA, 91:6151-55仰4在所有CD3+淋己細胞和B細胞上表達）。因此，在一個實施方式 中，開發(fā)一種基因修飾的動物使其保留內(nèi)源性小鼠啟動子和其他調(diào)控元件W使得所述動物 產(chǎn)生能夠經(jīng)歷正常的T細胞發(fā)育和譜系選擇的T細胞可能是有益的。
[0052]因此，在不同實施方式中，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物，所述非人動物 例如在其內(nèi)源性T細胞共受體基因座（例如CD4基因座）包含編碼嵌合的人/非人T細 胞共受體多膚的核巧酸序列。在一個實施方式中，所述嵌合多膚的人部分包含全部或基本 上全部的人T細胞共受體胞外域。在一個實施方式中，所述嵌合多膚的非人部分包含非人 T細胞共受體的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。在一個實施方式中，所述非人動物表達功能性的嵌合 的T細胞共受體多膚。因此，在一個方面，本發(fā)明提供了一種基因修飾的非人動物，所述非 人動物在其內(nèi)源性CD4基因座包含編碼嵌合的人/非人CD4多膚的核巧酸序列，其中所述 嵌合多膚的人部分包含全部或基本上全部的人CD4的胞外域，其中非人部分至少包含非人 CD4的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域，和其中所述動物表達功能性的嵌合的CD4多膚。在一個方面，所 述非人動物僅表達人源化的CD4多膚，即嵌合的人/非人CD4多膚，并且不表達來自其內(nèi)源 性CD4基因座的功能性的內(nèi)源性非人CD4蛋白。
[0053] 在一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多膚的人部分包含全部或基本上全 部的人CD4多膚的胞外域。在另一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多膚至少包含 全部或基本上全部的所述人CD4多膚的MHCII結(jié)合結(jié)構(gòu)域（例如Dl和D2結(jié)構(gòu)域的大部 分）；在一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多膚的人部分包含全部或基本上全部的 所述人CD4多膚的D1、D2和D3結(jié)構(gòu)域；在又一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多 膚的人部分包含全部或基本上全部的CD4免疫球蛋白樣結(jié)構(gòu)域，例如稱為Dl、D2、D3和D4 的結(jié)構(gòu)域。在又一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多膚的人部分在其人部分中包 含全部或基本上全部的負責與MHCII和/或T細胞受體的胞外部分相互作用的人CD4序 列。在又一個實施方式中，所述嵌合的人/非人CD4多膚的人部分包含全部或基本上全部 的負責與MHCII和/或T細胞受體的可變結(jié)構(gòu)域相互作用的人CD4的胞外部分。因此，在 一個實施方式中，編碼所述嵌合的CD4多膚的人部分的核巧酸序列包含全部或基本上全部 的人CD4結(jié)構(gòu)域D1-D2的編碼序列（例如，人CD4基因外顯子3的一部分和外顯子4-5);在 另一個實施方式中，其包含全部或基本上全部的人CD4D1-D3的編碼序列（例如，人CD4外 顯子3的一部分和外顯子4-6)。因此，在一個實施方式中，編碼嵌合的人/非人CD4的核巧 酸序列包含編碼全部或基本上全部人CD4的D1-D3結(jié)構(gòu)域的核巧酸序列。在另一個實施方 式中，編碼所述嵌合的CD4多膚的人部分的核巧酸序列包含人CD4基因的D1-D4結(jié)構(gòu)域的 編碼序列。在另一個實施方式中，所述核巧酸序列可W包含編碼小鼠CD4信號膚的核巧酸 序列，例如由小鼠基因的外顯子2-3的部分編碼的區(qū)域。在另一個實施方式中，所述核巧酸 序列可W包含編碼人CD4信號膚的核巧酸序列。在一個實施方式中，所述嵌合的人/非人 CD4多膚包含如SEQIDN0:4所示的氨基酸序列，和所述嵌合多膚的人部分大致跨SEQID NO: 4的氨基酸27-319 (其單獨WSEQIDNO: 57表示）。
[0054] 在一個實施方式中，所述非人動物表達嵌合的人/非人CD4多膚序列。在一個實 施方式中，所述嵌合的CD4序列的人部分包含一個或多個保守的或非保守的修飾。
[0055] 在一個方面，本申請?zhí)峁┝艘环N表達人CD4序列的非人動物，其中所述人CD4序列 與人CD4序列具有至少約85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%的同一性。在一個特定 實施方式中，所述人CD4序列與實施例中描述的人CD4序列具有至少約90%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %的同一性。在一個實施方式中，所述人CD4序列包含一個或多個保守的取 代。在一個實施方式中，所述人CD4序列包含一個或多個非保守的取代。
[0056] 在一些實施方式中，一部分例如所述嵌合CD4的人部分可W包含基本上全部的本 申請所示的序列（例如，基本上全部的本申請所示的蛋白結(jié)構(gòu)域）?；旧先啃蛄型ǔ?包括據(jù)信代表所述蛋白特定部分（例如特定功能性結(jié)構(gòu)域等）的85%、90%、95%、96%、 97 %、98 %或99 %的氨基酸。本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解可W根據(jù)所使用的比對和結(jié)構(gòu)域預(yù)測 方法對功能性結(jié)構(gòu)域的邊界進行微小改變。
[0057] 在一個方面，所述嵌合的人/非人CD4多膚的非人部分至少包含所述非人CD4多 膚的跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。由于CD4胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域具有重要的功能，因此在基因工程改造的動 物中保留內(nèi)源性非人（例如小鼠）序列確保保持共受體具有適當?shù)募毎麅?nèi)信號和其他功 能。在一個實施方式中，所述非人動物是小鼠，和所述非人CD4多膚是小鼠CD4多膚。盡管 在實施例中描述了特定的小鼠CD4序列，但是來源于其的任意適宜序列例如包含保守的/ 非保守的氨基酸取代的序列均包括在本申請中。在一個實施方式中，所述嵌合的CD4共受 體的非人部分包含未被人源化的內(nèi)源性CD4的任意序列。
[0058] 本申請所述的非人動物在其內(nèi)源性基因座中可W包含編碼嵌合的人/非人CD4多 膚的核巧酸序列。在一個方面，其導(dǎo)致內(nèi)源性CD4基因的一部分被編碼人CD4多膚一部分 的核巧酸序列取代。在一個實施方式中，此類取代是編碼例如全部或基本上全部的非人CD4 的胞外域的內(nèi)源性核巧酸序列，例如編碼至少全部或基本上全部的非人CD4的第一免疫球 蛋白樣結(jié)構(gòu)域（即Dl)的序列（例如編碼全部或基本上全部的非人CD4的結(jié)構(gòu)域D1-D2的 序列，例如編碼全部或基本上全部的非人CD4的結(jié)構(gòu)域D1-D3的序列，編碼全部或基本上全 部的非人CD4的結(jié)構(gòu)域D1-D4的序列）被編碼其的人核巧酸序列取代。在一個實施方式中， 所述取代產(chǎn)生包含負責與MHC II和/或T細胞受體胞外部分相互作用的人CD4序列的嵌 合蛋白。在又一個實施方式中，所述取代產(chǎn)生包含負責與MHC和/或T細胞受體的可變結(jié) 構(gòu)域相互作用的人CD4序列的嵌合蛋白。在一個實施方式中，所述取代不包含編碼非人CD 多膚的至少跨膜和胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域的CD4序列的取代。因此，在一個方面，所述非人動物表達來 自內(nèi)源性非人CD4基因座的嵌合的人/非人CD4多膚。在又一個實施方式中，所述取代產(chǎn) 生包含如SEQIDN0:4所示的多膚序列的蛋白。
[0059] 在一個實施方式中，本申請?zhí)峁┝吮旧暾埶龅那逗系娜?非人CD4基因座（例 如嵌合的人/曬齒動物CD4基因座，例如嵌合的人/小鼠CD4基因座）的核巧酸序列。在 一個方面，由于所述嵌合的人/非人（例如人/曬齒動物，例如人/小鼠）CD4序列被置于 內(nèi)源性非人（例如曬齒動物，例如小鼠）CD