具有沉默突變的重組rsv、疫苗及其相關(guān)方法
【專(zhuān)利說(shuō)明】具有沉默突變的重組RSV、疫苗及其相關(guān)方法
[0001]相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002]本申請(qǐng)要求2013年3月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/781，228和2013年10月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)?zhí)?1/890，500的優(yōu)先權(quán)，兩者均通過(guò)引用以其全文結(jié)合。
[0003]背景
[0004]呼吸道合胞病毒(RSV)導(dǎo)致下呼吸道感染。免疫功能低下的患者、早產(chǎn)兒和兒童尤其處于嚴(yán)重疾病的風(fēng)險(xiǎn)。RSV是嬰兒中病毒性死亡的主要原因。RSV治療集中于預(yù)防感染和改善呼吸。帕利珠單抗是可以預(yù)防性地給藥的一種人源化單克隆抗體。帕利珠單抗在RSV感染之后是無(wú)效的，并且保護(hù)在治療停止之后不久終止。疫苗目前不可用于RSV。候選減毒RSV疫苗由于在嬰兒中的次最優(yōu)免疫原性和導(dǎo)致針對(duì)不希望的野生型序列的遺傳回復(fù)的次最優(yōu)穩(wěn)定性而已經(jīng)失敗。參見(jiàn)騰(Teng)，傳染性病癥一一藥物靶標(biāo)(Infect1usDisorders - Drug Targets)，2012，12 (2): 129-3。因此，需要發(fā)現(xiàn)為適當(dāng)免疫源性的、足夠穩(wěn)定的且安全用于嬰兒的一種減毒RSV疫苗。
[0005]由于遺傳密碼的冗余性，單個(gè)氨基酸由密碼子的多重序列編碼，這些密碼子有時(shí)被稱(chēng)為同義密碼子。在不同物種中，同義密碼子或多或少頻繁地被使用，有時(shí)被稱(chēng)為密碼子偏愛(ài)。將出現(xiàn)頻率過(guò)低的同義密碼子遺傳工程化成一種基因的編碼序列已顯示導(dǎo)致降低的蛋白質(zhì)翻譯速率，而無(wú)蛋白質(zhì)的氨基酸序列的變化。米勒(Mueller)等人報(bào)道通過(guò)密碼子偏愛(ài)的變化進(jìn)行病毒減毒。參見(jiàn)科學(xué)(Science)，2008，320:1784。還參見(jiàn)W0/2008121992、W0/2006042156、伯恩斯(Burns)等人，病毒學(xué)雜志(J Virology)，2006，80 (7):3259 以及米勒等人，病毒學(xué)雜志，2006，80 (19):9687ο
[0006]盧昂戈(Luongo)等人報(bào)道通過(guò)反向遺傳學(xué)提高一種候選減毒活呼吸道合胞病毒疫苗的遺傳和表型穩(wěn)定性。參見(jiàn)病毒學(xué)雜志，2012，86 (19): 10792。
[0007]道丘(Dochow)等人報(bào)道副粘液病毒聚合酶蛋白中的獨(dú)立結(jié)構(gòu)域。生物化學(xué)雜志(J B1l Chem)，2012，287:6878 - 91。
[0008]美國(guó)專(zhuān)利8，580, 270報(bào)道RSV F多肽序列。美國(guó)專(zhuān)利7，951，384報(bào)道它涵蓋一種VLP RSV 疫苗。
[0009]在此引用的參考文獻(xiàn)并非對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的承認(rèn)。
[0010]概述
[0011]在某些實(shí)施例中，本披露涉及呼吸道合胞病毒(RSV)的多核苷酸序列。在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的所希望的核酸序列和突變體的分離或重組的核酸和多肽。在某些實(shí)施例中，還提供包含在此披露的核酸和多肽的分離或重組的RSV(例如，減毒重組RSV)，還提供適合用作疫苗的包含這類(lèi)核酸、多肽和RSV基因組的免疫原性組合物。還涵蓋含有呈拷貝的核酸(例如，cDNA)形式的這些核酸和突變體的減毒或滅活的RSV。
[0012]在某些實(shí)施例中，本披露涉及分離的核酸、具有密碼子去優(yōu)化的重組呼吸道合胞病毒(RSV)、由其產(chǎn)生的疫苗以及與其相關(guān)的疫苗接種方法。在某些實(shí)施例中，重組RSV病毒包含A2株系的基因NSl、NS2、N、P、M、SH、G、F、M2、以及L，品系19，或其Long株系或變體。在某些實(shí)施例中，密碼子去優(yōu)化是在非結(jié)構(gòu)基因NSl和NS2中并且任選地在一種基因G中且任選地在一種基因L中。在其他實(shí)施例中，基因SH被缺失。在其他實(shí)施例中，基因F被突變，例如，對(duì)應(yīng)于RSV株系19F蛋白的殘基557的一種I至V突變。
[0013]在某些實(shí)施例中，本披露涉及編碼去優(yōu)化的基因NSl和/或NS2以及一種野生型人RSV或變體的任選地基因G和任選地基因L的分離的核酸，其中這些核苷酸被取代，這樣使得用于產(chǎn)生Gly的密碼子是GGT，用于產(chǎn)生Asp的密碼子是GAT，用于產(chǎn)生Glu的密碼子是GAA，用于產(chǎn)生His的密碼子是CAT，用于產(chǎn)生Ile的密碼子是ATA，用于產(chǎn)生Lys的密碼子是AAA，用于產(chǎn)生Leu的密碼子是CTA，用于產(chǎn)生Asn的密碼子是AAT，用于產(chǎn)生Gln的密碼子是CAA，用于產(chǎn)生Val的密碼子是GTA，用于產(chǎn)生Tyr的密碼子是TAT或其組合。在某些實(shí)施例中，分離的核酸中的一種基因進(jìn)一步包含這些單獨(dú)密碼子中的至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)或全部的一種組合。在某些實(shí)施例中，分離的核酸中的一種基因包含這些密碼子中的至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)或50個(gè)或更多個(gè)。
[0014]在某些實(shí)施例中，本披露涉及如在此披露的分離的核酸，其中核苷酸被取代，這樣使得用于產(chǎn)生Ala的密碼子是GCG，用于產(chǎn)生Cys的密碼子是TGT，用于產(chǎn)生Phe的密碼子是TTT，用于產(chǎn)生Pro的密碼子是CCG，用于產(chǎn)生Arg的密碼子是CGT，用于產(chǎn)生Ser的密碼子是TCG，或用于產(chǎn)生Thr的密碼子是ACG或其組合。在某些實(shí)施例中，含有該核酸的一種基因包含這些單獨(dú)密碼子中的至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)、九個(gè)、十個(gè)、十一個(gè)、十二個(gè)、十三個(gè)、十四個(gè)、十五個(gè)、十六個(gè)或全部的一種組合。在某些實(shí)施例中，分離的核酸中的一種基因進(jìn)一步包含這些密碼子中的至少20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)或50個(gè)或更多個(gè)。
[0015]在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有SEQ ID N0:5MGXiNx2Lsx3Ikx4Rlqnlx5X6Ndevallkitcyx7Dklix8Ltnalakax9Ihtiklngivfx1HvitssXiiX12CPX13Nx14ivvksnfttmpx15lx16nggyix17ex18x19elthcsqx20ngx21x22x23dnceikfsx24x25lx26dsx27mtx28yx29x3
°QX31SX32LLGX33DLX34X35的 NS1，其中 X 1-X35是任何氨基酸或 X 1是 S 或 C ;X 2是 S 或 T ;X 3是 M或V ;x4是V或I ;X 5是F或L ;X 6是D或N ;X 7是T或A ;X 8是H、L或Q ;X 9是V或T ;X 1(]是V或 I ;Xn是 D 或 E ;X 12是 1、A 或 V ;X 13是 N 或 D ;X 14是 N 或 S ;X 15是 V、I 或 A ;X 16是 Q 或 R ;X17是W或任何氨基酸；x 18是M或L ;X 19是M或I ;X 2°是P或L ;X 21是L或V ;X 22是L、M或I ;X23是D或V ;X 24是K或R ;X 25是K或R ;X 26是S或任何氨基酸；X 27是T或V ;X 28是N或D ;X29是M或I ;X 3°是N或S ;X 31是L或I ;X 32是E或D ；X 33是F或L ；X 34是N或H ;并且X 35是P或S或缺失。
[0016]在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼RSV的NS1，如以NCBI 登錄號(hào) ΝΡ_044589.1、ΝΡ_056856.UP04544.UAEQ63513.UAFM55237.UAFV32554.1、Q86306.1、AFV32528.1、AFM55248.1、AFM95358.1、AFV32568.1、ACY68428.1、CBW45413.1、AC083290.UAFM55347.UCBW45433.UAEQ63459.UAFM55204.UAFV32572.UAFV32558.1、CBW45429.1、CBW45445.1、AFV32596.1、CBW45481.1、CBW47561.1、Ρ24568.1、AAR14259.1、CBW45451.1、 CBW45447.1、 CBW45471.1、 ΒΑΕ96914.1、 CBW45463.1、 CBW45473.1 或CBW45467.1提供的；或包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的變體。
[0017]在某些實(shí)施例中，本披露涉及一種分離的核酸，該分離的核酸包含SEQ ID NO:6或SEQ ID Ν0:7或與其具有60%、70%、80%、90%、95%或更大序列一致性的一個(gè)序列。
[0018]在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有SEQ ID Ν0:8,MxiTx2X3X4X5X6Tx7Qx8Lx9Itdmrpx1SxiiXi2Xi3Xi4Ixi5Sltxi6Xi7Iithxi8Fiylinxi9Ecivx2oKldEx21Qatx22x23flvnyemx24llhx25vgsx26x27ykkx28teyntkygtfpmpifix29hx30gfx31ecigx32kptkhtpiix33kyd
LNP 的 NS2，
[0019]其中X1-X33是任何氨基酸或
[0020]X1是 D 或 S ;X 2是 T、A 或 K ;X 3是 H、S 或 N ;X 4是 N 或 P ;X 5是 D、G 或 E ;X 6是 T 或N ;X7是 P、M、Q、S 或 A ;X 8是 R 或 G ;X 9是 M 或 I ;X 1(]是 L 或 M ;X 11 是 L、M 或 I ;X 12是 1、D 或E ;X13是 T 或 S ;X 14是 I 或 V ;X 15是 I 或 T ;X 16是 R 或 K ；R 17是 D 或 E ；R 18是 R 或 K ；R 19是 H或N ;X2°是R或K ;X 21是R或K ;X 22是F或L ;X 23是T或A ；X 24是K或N ；X 25是K或R ；X 26是T或A ;X27是K或I ;X 28是T或S ;X 29是N或任何氨基酸43°是0或6 331是1^或1 ;X32是I或V ;并且X33是Y或H。
[0021]在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的核酸，這些核酸編碼具有如以NCBI登錄號(hào)
[0022]NP_044590.1、NP_056857.1、CBW45420.1、AFM95337.1、CBW45416.1、CBW45430.1、AFV32529.1、Q86305.1、AEQ63383.1、CBW45424.1、AFM55546.1、CBW45444.1、P04543.2、AFM55326.UAFM55425.UAFM55381.UAFM55458.UAFM55216.UAAB59851.UAEQ63372.1、AFM55337.UCBW45426.UAFV32515.UAFV32519.UAAR14260.UCBW47562.UAFV32643.1、P24569.1、AFV32657.1、AFI25256.1、CBW45480.1、AFV32605.1、AEQ63580.1、AFV32627.1、AFV32665.UCBW45482.UCBW45478.UCBW45462.UAEQ63635.UCBW45448.UCBW45464.1、CBW45484.1或CBW45474.1提供的RSV的NS2的NSl ;或包含一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸插入、缺失、取代或保守取代的變體。
[0023]在某些實(shí)施例中，本披露涉及一種分離的核酸，該分離的核酸包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO: 10或與其具有60%、70%、80%、90%、95%或更大序列一致性的一個(gè)序列。
[0024]在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的重組載體。
[0025]在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的核酸的一種減毒重組RSV。
[0026]在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的載體或在此披露的一種減毒重組RSV的表達(dá)系統(tǒng)。
[0027]在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的減毒重組RSV的疫苗。
[0028]在某些實(shí)施例中，本披露涉及疫苗接種方法，這些方法包括向處于RSV感染風(fēng)險(xiǎn)的受試者給予有效量的在此披露的疫苗。
[0029]在某些實(shí)施例中，受試者年齡小于2個(gè)月或6個(gè)月、在I歲以下、早產(chǎn)、患有先天性心臟病或肺病，經(jīng)受化學(xué)療法或移植，或被診斷患有哮喘、充血性心力衰竭或慢性阻塞性肺病、白血病或HIV/AIDS。
[0030]在某些實(shí)施例中，疫苗與莫維珠單抗、帕利珠單抗或針對(duì)RSV的F蛋白的抗原位點(diǎn)II中的表位的另一種人源化單克隆抗體組合給予。
[0031 ] 在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的載體，這些載體包含一種細(xì)菌人工染色體(BAC)和包含呼吸道合胞病毒(RSV)的一種核酸序列，并且該BAC含有對(duì)于在一種宿主細(xì)胞中產(chǎn)生一種感染性病毒顆粒來(lái)說(shuō)必需的所有基因。該核酸序列可以是與一種調(diào)控元件可操作的組合的一種病毒基因組或反基因組。典型地，該細(xì)菌人工染色體包含與一種選擇性標(biāo)志物(例如提供對(duì)一種抗生素的抗性的一種基因)可操作的組合的一種或多種基因，該一種或多種基因選自下組，該組由以下各項(xiàng)組成:因子F的oriS、repE、parA和parB基因。
[0032]該核酸序列可以是如在此所提供任選地突變的病毒(例如，任選地突變的RSV株系)的基因組或反基因組序列。在某些實(shí)施例中，表達(dá)載體是包含Mlu1、Cla1、BstBl、SacI限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)和任選地位于野生型病毒序列的區(qū)域外部或位于編碼病毒基因的序列外部或位于病毒基因組或反基因組外部的一個(gè)AvrII限制性核酸內(nèi)切酶切割位點(diǎn)的一種質(zhì)粒。在某些實(shí)施例中，該核酸序列進(jìn)一步包含與其可操作地組合的一種選擇性標(biāo)志物或報(bào)道基因，例如，編碼一種熒光蛋白的一種基因。
[0033]在某些實(shí)施例中，本披露涉及包含在此披露的一種或多種載體的分離的細(xì)菌，并且在其他實(shí)施例中，本披露涉及一種包含在此披露的一種或多種載體的分離的細(xì)胞。在某些實(shí)施例中，該載體包含一個(gè)RSV反基因組和選自下組的一種或多種載體，該組由以下各項(xiàng)組成:編碼RSV的N蛋白的一種載體、編碼RSV的P蛋白的一種載體、編碼RSV的L蛋白的一種載體、以及編碼RSV的M2-1蛋白的一種載體。典型地，該載體包含一種調(diào)控元件(例如，啟動(dòng)子)，并且分離的真核細(xì)胞表達(dá)活化該調(diào)控元件的一種核酸或多肽，例如，編碼活化該啟動(dòng)子下游的轉(zhuǎn)錄的一種多肽。在某些實(shí)施例中，該啟動(dòng)子是T7，并且活化該啟動(dòng)子下游的轉(zhuǎn)錄的多肽是T7RNA聚合酶。
[0034]在某些實(shí)施例中，本披露涉及產(chǎn)生呼吸道合胞病毒(RSV)顆粒的方法，這些方法包括將具有一種BAC基因的一種載體和一個(gè)RSV反基因組插入一種分離的真核細(xì)胞中，并且在使得形成RSV病毒粒子的條件下將選自下組的一種或多種載體插入該細(xì)胞中，該組由以下各項(xiàng)組成:編碼RSV的N蛋白的一種載體、編碼RSV的P蛋白的一種載體、編碼RSV的L蛋白的一種載體、以及編碼RSV的M2-1蛋白的一種載體。將一種載體插入一種細(xì)胞中可通過(guò)物理注入、電穿孔或在使得該載體進(jìn)入該細(xì)胞的條件下將該細(xì)胞與該載體進(jìn)行混合來(lái)發(fā)生。
[0035]在某些實(shí)施例中，本披露涉及相較于其他株系，品系19F557突變體病毒的穩(wěn)定性，以及使得表達(dá)品系19F的RSV甚至更熱穩(wěn)定的在557處的val。其他株系中在557位的Val也可能穩(wěn)定；因此557位對(duì)于熱穩(wěn)定性來(lái)說(shuō)是重要的。在某些實(shí)施例中，本披露涵蓋在任何F株系背景下，品系19F或其他RSV株系中在改進(jìn)RSV病毒的熱穩(wěn)定性的557位(任何氨基酸，例如，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)的其他突變。
[0036]在某些實(shí)施例中，本披露涵蓋包含557位的丙氨酸、纈氨酸、亮氨酸(例如，SEQ IDNO: 17的557位中的丙氨酸或亮氨酸)的RSV F多肽。
[0037]在某些實(shí)施例中，本披露涉及RSV F多肽的某一所希望的序列，例如包含557位的纈氨酸的品系19序列，例如SEQ ID NO: 17 ;以及編碼這些多肽的重組核酸。在某些實(shí)施例中，本披露涵蓋包含編碼這些多肽的核酸的重組載體和包含所述載體的細(xì)胞。
[0038]在某些實(shí)施例中，本披露涉及免疫原性組合物，這些組合物包含免疫有效量的在此披露的重組呼吸道合胞病毒(RSV)、RSV多肽、RSV顆粒、RSV病毒樣顆粒和/或核酸。在某些實(shí)施例中，本披露涉及用于刺激個(gè)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。在某些實(shí)施例中，在一種生理學(xué)上可接受的載體中向該個(gè)體給予免疫有效量的在此披露的一種RSV、多肽和/或核酸。
[0039]在某些實(shí)施例中，本披露涉及用于在此披露的用途的包含在此披露的核酸的藥物和疫苗產(chǎn)品。
[0040]在某些實(shí)施例中，本披露涉及在此披露的核酸或載體用于制造用于在此披露的用途的一種藥物的用途。
[0041]附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明
[0042]圖1示出具有在人基因中和特定RSV株系中最少使用的密碼子的一個(gè)表。
[0043]圖2示出BEAS-2B(頂部)和Vero細(xì)胞系(底部)中kRSV-dNSlh的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)。kRSV-A2(空心圓圈)和kRSV-dNSh (實(shí)心圓圈)在37°(:下以0.01的MOI感染的HEp_2 (A)、Vero細(xì)胞(B)和BEAS-2B細(xì)胞(C)中以及在以0.2 (D)或2.0 (E)的MOI感染的分化NHBE/ALI細(xì)胞中的生長(zhǎng)曲線。
[0044]圖3示出關(guān)于使用在此披露的某些實(shí)施例的病毒載量實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)。在0.2的MOI下NHBE細(xì)胞感染的時(shí)間進(jìn)程圖像，這些圖像示出由重組病毒產(chǎn)生的mKate2熒光。*P〈0.05
[0045]圖4示出在通過(guò)重組工程將galK操縱子插入BAC-RSV中之后的凝膠。MluI消化。泳道I，梯度標(biāo)志物。微量制備BAC DNA (泳道2至7)。泳道8，親本BAC-RSV “C2”克隆。泳道9，含galK質(zhì)粒。galK操縱子具有充當(dāng)用于通過(guò)同源重組引入galK的標(biāo)志物的一個(gè)Mlu I限制位點(diǎn)。
[0046]圖5示出在通過(guò)重組工程使galK操縱子從BAC-RSV中缺失之后的凝膠。含galK質(zhì)粒(泳道2)、BAC微量制備DNA (泳道3-7)以及親本BAC-RSV克隆C2 (泳道8)的MluI消化。
[0047]圖6A-6E示意性地示出用于產(chǎn)生BAC-RSV的步驟。產(chǎn)生具有RSV區(qū)段的三種質(zhì)粒(參見(jiàn)實(shí)驗(yàn))；A)將pKBS3在BstBl和Mlul位點(diǎn)處切割以便線性化，并且連接至一個(gè)寡核苷酸銜接子，從而提供PKBS5 ；B)將具有Sacl和Clal的pSynRSV#2切割且連接至pKBS5，從而提供PKBS5-2 ；C)將具有Avrll和Mlul的pSynRSV#3切割且連接至pKBS5_2，從而提供pKBS5_2_3 ；D)將具有BstBl和Sacl的pSynRSV#l切割且連接至pKBS5_2_3，從而提供pKBS5_l_2_3 ；E)。重組工程用于使兩個(gè)Clal位點(diǎn)之間的核苷酸缺失，從而產(chǎn)生pSynRSV-品系 19F。
[0048]圖7示出顯示指示具有F基因1557至V突變的一種RSV株系的免疫源性的數(shù)據(jù)。將小鼠用指示劑量的A2-K-品系19F、A2-品系19F-1557V或A2-K-A2GF感染并且在29天之后用RSV株系12-35激發(fā)。在激發(fā)后第4天測(cè)量肺病毒載量。虛線指示檢測(cè)限。
[0049]圖8示出指示具有A2-品系19F基因1557至V突變(SEQ ID NO: 17)的RSV株系的優(yōu)異熱穩(wěn)定性的數(shù)據(jù)。在所指示的溫度下孵育病毒并且每天測(cè)量病毒滴度持續(xù)6天。在4°C下的結(jié)果在病毒之間是統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的(P〈0.01)。在37°C下的結(jié)果展示相同表型。
[0050]圖9示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢(xún)問(wèn)序列)與典型RSV株系19序列(目標(biāo)序列)的RSV序列比較。
[0051]圖10示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢(xún)問(wèn)序列)與來(lái)自專(zhuān)利US7，951，384的序列61 (目標(biāo)序列)的RSV序列比較。
[0052]圖10示出株系19，I557V突變(SEQ ID NO: 17)(詢(xún)問(wèn)序列)與來(lái)自專(zhuān)利US8，580，270的序列12 (目標(biāo)序列)的RSV序列比較。
[0053]圖12示出關(guān)于在此披露的實(shí)施例的減毒、功效和免疫源性的數(shù)據(jù)。(A)將6-8周齡 BALB/c 小鼠(η = 5/ 組)用 1.6 X 105FFU