行免疫接種時(shí)，宿主的免疫系統(tǒng)通過產(chǎn)生特異于RSV病毒蛋白例如F和G糖蛋白的抗體而響應(yīng)于疫苗。由于該疫苗接種，宿主變得對(duì)RSV感染至少部分地或完全地免疫，或?qū)Πl(fā)展中度或嚴(yán)重的RSV感染，特別是下呼吸道RSV感染具有抗性。
[0163]給予疫苗的宿主可以是易感于RSV感染或緊密相關(guān)的病毒感染的任何哺乳動(dòng)物，并且宿主能夠產(chǎn)生針對(duì)接種株系的抗原的保護(hù)性免疫應(yīng)答。因而，適合的宿主包括人、非人靈長(zhǎng)類動(dòng)物、牛、馬的、豬、綿羊、山羊、兔、嚙齒目動(dòng)物等。因此，本披露提供了用于產(chǎn)生用于各種人用和獸用的疫苗的方法。
[0164]將含有本披露的RSV的疫苗組合物給予易感于RSV感染或以其他方式有RSV感染風(fēng)險(xiǎn)的宿主以便增強(qiáng)該宿主的自身免疫應(yīng)答能力。這樣的量被定義為“免疫原性有效劑量”。在此用途中，精確的量同樣取決于宿主的健康狀態(tài)和體重、給藥方式、制劑性質(zhì)。疫苗制劑應(yīng)提供足以有效保護(hù)宿主患者免患嚴(yán)重的或威脅生命的RSV感染的量的本披露的修飾的RSV。
[0165]根據(jù)本披露產(chǎn)生的RSV可以與其他亞組或株系的病毒組合以實(shí)現(xiàn)針對(duì)多種RSV亞組或株系的保護(hù)，或者這些株系的保護(hù)性表位可以被工程化到如在此所述的一種病毒中。典型地，不同的病毒將呈混合物并且同時(shí)給予，但還可以單獨(dú)給予。例如，因?yàn)檫@兩個(gè)RSV亞組的F糖蛋白在氨基酸序列上的差異僅為約11%，這種相似性是如在用RSV或F抗原免疫并且用異源株系激發(fā)的動(dòng)物中觀察到的交叉保護(hù)性免疫應(yīng)答的基礎(chǔ)。因此，用一種株系免疫可以防御相同或不同亞組的不同株系。
[0166]在一些情況下，可能希望將本披露的RSV疫苗與誘導(dǎo)針對(duì)其他抗原，特別是其他兒童病毒的保護(hù)性應(yīng)答的疫苗組合。例如，本披露的RSV疫苗可以與例如描述在通過引用結(jié)合在此的克萊門特(Clements)等人，臨床微生物學(xué)雜志(J.Clin.Microb1l.)29:1175-1182(1991)中的副流感病毒疫苗同時(shí)給予。在本披露的另一方面，RSV可以用作用于其他呼吸道病原體如副流感病毒的保護(hù)性抗原的載體，其方式為將編碼這些保護(hù)性抗原的序列并入用于產(chǎn)生如在此所述的感染性RSV的RSV基因組或反基因組中。
[0167]可以執(zhí)行本披露的疫苗組合物的單次或多次給藥。在新生兒和嬰兒中，可能需要多次序貫給藥以引發(fā)足夠的免疫性水平?？梢栽谏牡谝粋€(gè)月內(nèi)開始給藥，或者在約兩個(gè)月大時(shí)之前，典型地不晚于六個(gè)月大時(shí)，并且在整個(gè)童年時(shí)期間隔地，如間隔兩個(gè)月、六個(gè)月、一年或兩年給藥，如維持足夠的天然(野生型)RSV感染防御水平所必需的。同樣，特別易感于重復(fù)的或嚴(yán)重的RSV感染的成年人，例如像衛(wèi)生保健工作者、日常護(hù)理工人、幼兒的家庭成員、老年人(超過55、60、或65歲)、心肺功能受損的個(gè)體，可能需要多次免疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)免疫性的水平可以通過測(cè)量中和分泌和血清抗體的量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且在必要時(shí)調(diào)整劑量或重復(fù)疫苗接種以維持所希望的保護(hù)水平。另外，不同的疫苗病毒可能有利于不同的受者組。例如，表達(dá)富集T細(xì)胞表位的額外蛋白的工程化RSV株系相比嬰兒可能特別有利于成人。
[0168]在本披露的又一個(gè)方面，RSV被用作用于呼吸道的瞬時(shí)基因治療的載體。根據(jù)本實(shí)施例，重組RSV基因組或反基因組并入能夠編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的序列。目標(biāo)基因產(chǎn)物受相同或不同啟動(dòng)子的控制，該啟動(dòng)子控制RSV表達(dá)。將通過共表達(dá)重組RSV基因組或反基因組與N、P、L和M2-1蛋白并且包含編碼目標(biāo)基因產(chǎn)物的序列而產(chǎn)生的感染性RSV給予患者。給藥典型地是通過氣溶膠、噴霧器或其他局部施用給予正在接受治療的患者的呼吸道。以足以引起所希望基因產(chǎn)物的治療或預(yù)防水平的表達(dá)的量給予重組RSV。以此方法給予的代表性基因產(chǎn)物的實(shí)例包括那些編碼例如特別適合于瞬時(shí)表達(dá)的那些的那些基因產(chǎn)物，例如白介素_2、白介素_4、γ-干擾素、GM-CSF、G-CSF、促紅細(xì)胞生成素、和其它細(xì)胞因子、葡糖腦苷脂酶、苯丙氨酸羥化酶、囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白(CFTR)、次黃嘌呤-鳥嘌呤磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞毒素、腫瘤抑制基因、反義RNA、以及疫苗抗原。
[0169]在某些實(shí)施例中，本披露涉及免疫原性組合物(例如，疫苗)，該免疫原性組合物包含免疫有效量的本發(fā)明的重組RSV(例如，減毒的活重組RSV或滅活的非復(fù)制型RSV)、免疫有效量的在此披露的多肽、和/或免疫有效量的在此披露的核酸。
[0170]在某些實(shí)施例中，本披露涉及用于刺激個(gè)體的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答的方法。在這些方法中，免疫有效量的在此披露的重組RSV、免疫有效量的在此披露的多肽、和/或免疫有效量的在此披露的核酸以生理學(xué)上可接受的載體給予個(gè)體。
[0171]典型地，載體或賦形劑是藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑，如無菌水、鹽水溶液、緩沖鹽水溶液、葡萄糖水溶液、甘油水溶液、乙醇、或其組合。根據(jù)本領(lǐng)域確立的方案實(shí)現(xiàn)確保無菌性、pH、等滲性以及穩(wěn)定性的此類溶液的制備?？傮w上，載體或賦形劑經(jīng)選擇，以便最小化過敏和其他不良效應(yīng)，并且以便適合具體給藥途徑，例如皮下、肌內(nèi)、鼻內(nèi)、口服、局部等。所得的水溶液可以例如被包裝以供原樣使用，或者被凍干，在給藥前將該凍干制劑與無菌溶液組合。
[0172]在某些實(shí)施例中，給予足以刺激特異于一種或多種株系的RSV的免疫應(yīng)答的量的RSV(或RSV組分)(例如，給予免疫有效量的RSV或RSV組分)。優(yōu)選地，RSV的給予引發(fā)保護(hù)性免疫應(yīng)答。用于引發(fā)保護(hù)性抗病毒免疫應(yīng)答的劑量和方法可調(diào)適來產(chǎn)生針對(duì)RSV的保護(hù)性免疫應(yīng)答，這些劑量和方法是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知。參見，例如，美國(guó)專利號(hào) 5，922，326 ;賴特(Wright)等人(1982)感染免疫學(xué)(Infect.1mmun.) 37:397-400 ;吉姆(Kim)等人(1973)兒科學(xué)(Pediatrics)52:56-63 ;以及賴特等人(1976)兒科學(xué)雜志(J.Pediatr.) 88:931-936。例如，病毒可在每給予劑量約103_106pfu (噬斑形成單位)的范圍內(nèi)來提供(例如，每給予劑量104-105pfu)。典型地，劑量將根據(jù)例如年齡、身體狀況、體重、性別、飲食、給藥方式和時(shí)間、以及其他臨床因素來調(diào)整。預(yù)防性疫苗制劑可以例如通過使用針和注射器或無針注射裝置進(jìn)行皮下或肌內(nèi)注射來全身給予。優(yōu)選地，疫苗制劑例如通過滴劑、氣溶膠(例如，大顆粒氣溶膠(大于約10微米))，或噴入上呼吸道而鼻內(nèi)給藥。雖然任何上述遞送途徑都引起保護(hù)性全身免疫應(yīng)答，但鼻內(nèi)給藥賦予在病毒進(jìn)入位點(diǎn)處引發(fā)粘膜免疫性的額外益處。對(duì)于鼻內(nèi)給藥，減毒活病毒疫苗通常是優(yōu)選的，例如減毒的、冷適應(yīng)的和/或溫度敏感的重組RSV，例如嵌合重組RSV。作為替代或補(bǔ)充的減毒活病毒疫苗，例如可以使用殺死的病毒疫苗、核酸疫苗、和/或多肽亞單位疫苗，如沃爾什(Walsh)等人(1987)傳染病雜志(J.1nfect.Dis.) 155:1198-1204 和墨菲等人(1990)疫苗(Vaccine) 8:497-502 所建議的。
[0173]在某些實(shí)施例中，減毒重組RSV如在疫苗中那樣使用并且是充分減毒的，這樣使得感染的癥狀，或至少嚴(yán)重感染的癥狀不會(huì)發(fā)生在用減毒RSV免疫(或以其他方式感染)的大多數(shù)個(gè)體中-在其中病毒組分(例如，在此的核酸或多肽)用作疫苗或免疫原性組分的實(shí)施例中。然而，毒力典型地被充分廢止，這樣使得輕度或嚴(yán)重的下呼吸道感染通常不發(fā)生在已經(jīng)接種疫苗的宿主或偶見宿主中。
[0174]雖然用單劑量刺激保護(hù)性免疫應(yīng)答是優(yōu)選的，但可以通過相同或不同的途徑給予額外的劑量，以達(dá)到所希望的預(yù)防效果。在新生兒和嬰兒中，例如可能需要多次給藥以引發(fā)足夠的免疫性水平?？梢栽谡麄€(gè)童年時(shí)期間隔地給藥，如維持足夠的野生型RSV感染防御水平所必需的。同樣，特別易感于重復(fù)的或嚴(yán)重的RSV感染的成年人，例如像衛(wèi)生保健工作者、日常護(hù)理工人、幼兒的家庭成員、老年人、以及心肺功能受損的個(gè)體，可能需要多次免疫以建立和/或維持保護(hù)性免疫應(yīng)答。誘導(dǎo)免疫性的水平可以通過測(cè)量病毒中和分泌和血清抗體的量進(jìn)行監(jiān)測(cè)，并且在必要時(shí)調(diào)整劑量或重復(fù)疫苗接種以維持所希望的保護(hù)水平。
[0175]可替代地，免疫應(yīng)答可通過用病毒活體外或體內(nèi)靶向樹突細(xì)胞來刺激。例如，將增殖樹突細(xì)胞以足夠的量并持續(xù)足夠的時(shí)間段暴露于病毒，以允許樹突細(xì)胞捕獲RSV抗原。然后將細(xì)胞轉(zhuǎn)移到待通過標(biāo)準(zhǔn)靜脈內(nèi)移植方法進(jìn)行疫苗接種的受試者中。
[0176]任選地，用于RSV的預(yù)防性給藥的制劑還含有用于增強(qiáng)對(duì)RSV抗原的免疫應(yīng)答的一種或多種佐劑。適合的佐劑包括，例如:完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、皂苷、礦物凝膠如氫氧化鋁、表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂、普盧蘭尼克多聚醇、聚陰離子、肽、油或烴乳劑、卡介苗(BCG)、短小棒狀桿菌、以及合成佐劑QS-21。
[0177]如果需要的話，RSV預(yù)防性疫苗給予可以與一種或多種免疫刺激分子的給予相結(jié)合來進(jìn)行。免疫刺激分子包括具有免疫刺激、免疫增強(qiáng)以及促炎活性的各種細(xì)胞因子、淋巴因子和趨化因子，如白介素(例如，IL-U IL-2、IL-3、IL_4、IL-12、IL-13);生長(zhǎng)因子(例如，粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞(GM)-集落刺激因子(CSF));以及其他免疫刺激分子，如巨噬細(xì)胞炎性因子、Flt3配體、B7.1 ；B7.2等等。免疫刺激分子可以在與RSV相同的制劑中給予，或者可以單獨(dú)給予?？梢越o予蛋白質(zhì)或編碼該蛋白質(zhì)的表達(dá)載體來產(chǎn)生免疫刺激效應(yīng)。
[0178]雖然用特定亞組的特定株系的減毒RSV對(duì)個(gè)體進(jìn)行疫苗接種可以誘導(dǎo)針對(duì)不同株系和/或亞組的RSV的交叉保護(hù)，但如果需要的話，可以通過用來自至少兩種株系的減毒RSV(例如，每一種代表一個(gè)不同的亞組)對(duì)該個(gè)體進(jìn)行疫苗接種來增強(qiáng)交叉保護(hù)。類似地，減毒RSV疫苗可任選地與誘導(dǎo)針對(duì)其他感染性因子的保護(hù)性免疫應(yīng)答的疫苗組合。
[0179]實(shí)驗(yàn)
[0180]A2-品系19F-1557V病毒在BALB/c小鼠中是免疫原性的
[0181]這在圖7中顯示，其示出該病毒相比RSV A2和RSV A2-品系19F誘導(dǎo)更高水平的RSV中和血清抗體。圖7B顯示，即使是低輸入劑量，當(dāng)在初次感染后29天激發(fā)時(shí)，這種病毒也提供針對(duì)RSV異源株系激發(fā)的全面保護(hù)。對(duì)于RSV的其他兩個(gè)株系，A2-K-品系19F和A2-K-A2GF，沒有看到這種低劑量免疫下的全面保護(hù)，這允許突破再感染。這兩種病毒類似于A2-品系19F-1557V，除了 F蛋白，表明由該病毒編碼的I557V F蛋白對(duì)于該表型是重要的。
[0182]除了是免疫原性的(圖7A)，在A2-品系19F-1557V病毒是熱穩(wěn)定的。病毒的熱穩(wěn)定性被測(cè)量為病毒在4°C或37°C下孵育時(shí)在多天內(nèi)保持滴度的能力。結(jié)果表明，該病毒在兩個(gè)測(cè)試溫度下比A2_K_A2GF病毒更熱穩(wěn)走，在4 C下比A2_品系19F更穩(wěn)走。如上所述，F(xiàn)基因是這兩種病毒之間的唯一差異，表明這種獨(dú)特的F蛋白造成該表型。
[0183]A2-品系19F RSV株系比A2株系更穩(wěn)定，在19F蛋白的背景中557處的Val使該病毒甚至更穩(wěn)定。其他株系中557位的Val也可能穩(wěn)定-557位和穩(wěn)定性。在某些實(shí)施例中，本披露涵蓋在任何F株系背景下，影響病毒的熱穩(wěn)定性的557位(任何氨基酸，例如，丙氨酸、纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸)的其他突變。
[0184]具有NSl和NS2密碼子沉默突變的重組RSV的產(chǎn)生和生長(zhǎng)衰減
[0185]將在人類中罕見的密碼子用于制備具有NSl和NS2基因的重組RSV，下文稱為dNSlh和dNS2h。將在RSV中罕見的密碼子用于制備具有NSl和NS2基因的重組RSV，下文稱為dNSlv和dNS2v。圖1提供了用于確定最優(yōu)序列的表。重組RSV用針對(duì)NSl和NS2基因的以下核苷酸序列來制備。重要的是要注意，在測(cè)試密碼子之前，這是不可預(yù)測(cè)的，如果罕見人類密碼子或罕見密碼子將產(chǎn)生所希望的候選RSV疫苗。使用RSV序列罕見的密碼子的實(shí)驗(yàn)具有表達(dá)增加這種非預(yù)期和不良影響。使用人類序列罕見的密碼子具有表達(dá)增加這種期望的影響。比較人類序列罕見的NS密碼子和RSV序列罕見的NS密碼子的實(shí)驗(yàn)表明，人類序列罕見的的密碼子對(duì)于疫苗開發(fā)是優(yōu)先的。
[0186]dNSlh核苷酸系列(SEQ ID NO:6)相比野生型A2中的NSl，420個(gè)核苷酸中84個(gè)不同(20% )且140個(gè)密碼子中68個(gè)不同(48% )
[0187]SEQ ID NO:6
[0188]ATGGGTTCGAATTCGCTATCGATGATAAAAGTACGTCTACAAAATCTATTTGATAATGATGAAGTAGCGCTACTAAAAATAACGTGTTATACGGATAAACTAATACATCTAACGAATGCGCTAGCGAAAGCGGTAATACATACGATAAAACTAAATGGTATAGTATTTGTACATGTAATAACGTCGTCGGATATATGTCCGAATAATAATATAGTAGTAAAATCGAATTTTACGACGATGCCGGTACTACAAAATGGTGGTTATATATGGGAAATGATGGAACTAACGCATTGTTCGCAACCGAATGGTCTACTAGATGATAATTGTGAAATAAAATTTTCGAAAAAACTATCGGATTCGACGATGACGAATTATATGAATCAACTATCGGAACTACTAGGTTTTGATCTAAATCCGTAA
[0189]dNSlv核苷酸系列(SEQ ID NO: 7)相比野生型A2中的NSl，420個(gè)核苷酸中145個(gè)不同(34% )且140個(gè)密碼子中122個(gè)不同(87% )
[0190]SEQ ID NO:7
[0191]ATGGGGTCGAACTCGCTCTCGATGATCAAGGTCCGCCTCCAGAATCTCTTCGACAACGACGAGGTCGCGCTCCTCAAGATCACGTGTTACACGGACAAGCTCATCCACCTCACGAACGCGCTCGCGAAGGCGGTCATCCACACGATCAAGCTCAACGGGATCGTCTTCGTCCACGTCATCACGTCGTCGGACATCTGTCCGAACAACAACATCGTCGTCAAGTCGAACTTCACGACGATGCCGGTCCTCCAGAACGGGGGGTACATCTGGGAGATGATGGAGCTCACGCACTGTTCGCAGCCGAACGGGCTCCTCGACGACAACTGTGAGATCAAGTTCTCGAAGAAGCTCTCGGACTCGACGATGACGAACTACATGAACCAGCTCTCGGAGCTCCTCGGGTTCGACCTCAACCCGTAA
[0192]dNS2h核苷酸系列(SEQ ID NO:9)相比野生型A2中的NSl，420個(gè)核苷酸中82個(gè)不同(21% )且140個(gè)密碼子中73個(gè)不同(58% )
[0193]SEQ ID NO:9
[0194]ATGGATACGACGCATAATGATAATACGCCGCAACGTCTAATGATAACGGATATGCGTCCGCTATCGCTAGAAACGATAATAACGTCGCTAACGCGTGATATAATAACGCATAAATTTATATATCTAATAAATCATGAATGTATAGTACGTAAACTAGATGAACGTCAAGCGACGTTTACGTTTCTAGTAAATTATGAAATGAAACTACTACATAAAGTAGGTTCGACGAAATATAAAAAATATACGGAATATAATACGAAATATGGTACGTTTCCGATGCCGATATTTATAAATCATGATGGTTTTCTAGAATGTATAGGTATAAAACCGACGAAACATACGCCGATAATATATAAATATGATCTAAATCCGTAA
[0195]dNS2v核苷酸系列(SEQ ID NO: 10)相比野生型A2中的NS1，420個(gè)核苷酸中103個(gè)不同(27% )且140個(gè)密碼子中92個(gè)不同(73% )
[0196]SEQ ID NO: 10
[0197]ATGGACACGACGCACAACGACAACACGCCGCAGCGCCTCATGATCACGGACATGCGCCCGCTCTCGCTCGAGACGATCATCACGTCGCTCACGCGCGACATCATCACGCACAAGTTCATCTACCTCATCAACCACGAGTGTATCGTCCGCAAGCTCGACGAGCGCCAGGCGACGTTCACGTTCCTCGTCAACTACGAGATGAAGCTCCTCCACAAGGTCGGGTCGACGAAGTACAAGAAGTACACGGAGTACAACACGAAGTACGGGACGTTCCCGATGCCGATCTTCATCAACCACGACGGGTTCCTCGAGTGTATCGGGATCAAGCCGACGAAGCACACGCCGATCATCTACAAGTACGACCTCAACCCGTAA
[0198]將60-70%匯合的BEAS-2B細(xì)胞系用如上所述的重組病毒以0.01的MOI (感染復(fù)數(shù))感染(即，對(duì)于每100個(gè)細(xì)胞，存在一個(gè)感染性病毒顆粒)。這通過首先對(duì)感染前細(xì)胞計(jì)數(shù)，計(jì)算各孔中的細(xì)胞總數(shù)，然后計(jì)算每個(gè)病毒的感染量來進(jìn)行。在室溫下進(jìn)行感染I小時(shí)，然后洗去。將感染的細(xì)胞留在37°c孵育器中5% C02下持續(xù)多達(dá)96小時(shí)。在孵育和冷凍12、24、48、72以及96小時(shí)之后，取樣品。在收集所有時(shí)間點(diǎn)的樣品后，通過根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方案對(duì)Vero細(xì)胞系滴定來確定各樣本中病毒的量，并且對(duì)于各樣品計(jì)算低度(FFU/mL，這意味著每毫升的熒光焦點(diǎn)形成單位)。因?yàn)樗玫牟《驹诨蚪M中具有紅色熒光基因，在熒光顯微鏡下對(duì)感染的細(xì)胞計(jì)數(shù)，從而提供熒光焦點(diǎn)形成單位。每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)表示來自兩個(gè)獨(dú)立實(shí)驗(yàn)的一式兩份樣品。
[0199]如圖2所示，kRSV-dNSlh(人去優(yōu)化NS1+NS2病毒)的生長(zhǎng)在感染后72和96小時(shí)在BEAS-2B細(xì)胞系中衰減。據(jù)信，這是由于NSl和NS2蛋白比野生型病毒降低。
[0200]為低拷貝數(shù)設(shè)計(jì)的質(zhì)粒中的RSV的表達(dá)
[0201]感染性重組RSV(rRSV)可從轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒中回收。RSV N、P、L和M 21蛋白以及全長(zhǎng)反基因組RNA的共表達(dá)足以用于RSV復(fù)制。感染性RSV可以通過在T7啟動(dòng)子控制下將編碼N、P、L及M2-1蛋白以及反基因組cDNA的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到表達(dá)T7RNA聚合酶的BHK-21細(xì)胞(BSR細(xì)胞)中來產(chǎn)生。當(dāng)前研究實(shí)驗(yàn)室通常使用在質(zhì)粒PBR322中克隆的RSV反基因組cDNA(中等拷貝數(shù)，每個(gè)大腸桿菌15-20個(gè)拷貝)。為了維持該質(zhì)粒中的反基因組cDNA，使細(xì)菌在30°C和低通氣下生長(zhǎng)。然而，經(jīng)常經(jīng)歷質(zhì)粒重排和克隆損失。
[0202]發(fā)現(xiàn)包含病毒的附著糖蛋白(G)和融合(F)基因的RSV cDNA的級(jí)分不可在基于PUC的質(zhì)粒中克隆(大腸桿菌中500-700個(gè)質(zhì)?？截?。將該片段在稱為PLG338-30.5的低拷貝數(shù)(每大腸桿菌約5個(gè)拷貝)質(zhì)粒中克隆。質(zhì)粒PLG338-30被開發(fā)來增加克隆的慢病毒糖蛋白的穩(wěn)定性?？矊幇?Cunningham)等人，基因(Gene)，1993，124，93-98。假設(shè)大腸桿菌中的cDNA不穩(wěn)定性源于病毒糖蛋白序列中隱藏性大腸桿菌轉(zhuǎn)錄子啟動(dòng)子的存在。因此，細(xì)菌中“無啟動(dòng)子”質(zhì)粒內(nèi)的cDNA不穩(wěn)定性可能會(huì)出現(xiàn)，因?yàn)楫惓５鞍踪|(zhì)從隱藏性啟動(dòng)子表達(dá)，導(dǎo)致毒性因質(zhì)粒拷貝數(shù)加劇。
[0203]生成含有其中A2F基因被株系19F基因代替的RSV株系A(chǔ)2基因組的反基因組質(zhì)粒。它來源于首次在柯林斯等人，美國(guó)科學(xué)院院刊，1995,92(25):11563 - 11567和美國(guó)專利號(hào)6，790，449 (通過引用特此結(jié)合)中的反基因組質(zhì)粒。該反基因組被消化掉質(zhì)粒載體并且連接到PKBS3BAC中。
[0204]GalK重組工程試劑獲自NCI并且成功建立了 BAC-RSV反向遺傳學(xué)方案(圖4和5) ο 參見 http://web.ncifcrf.gov/research/brb/recombineeringlnformat1n.aspx，其通過引用特此結(jié)合。通過BAC重組工程的RSV cDNA的突變?cè)鰪?qiáng)了操縱RSV用于產(chǎn)生突變體的能力。該系統(tǒng)的另外一個(gè)益處是增強(qiáng)了 BAC載