用于治療癌癥的t-型鈣通道抑制劑的制作方法
【專利說明】用于治療癌癥的T-型巧通道抑制劑
[0001] 巧關(guān)申請的香叉引用
[0002] 本申請要求2013年1月10日提交的美國臨時申請?zhí)?1/751，038的權(quán)益，其整個 公開內(nèi)容通過引用并入本文。
技術(shù)領(lǐng)域
[0003] 本公開內(nèi)容設(shè)及治療上有用的化合物、治療方法和鑒定治療上有用的化合物的方 法。
【背景技術(shù)】
[0004] 在細(xì)胞周期的不同點(diǎn)的Ca2+流入對于進(jìn)展而言是關(guān)鍵性的，盡管化2+借W起作用 的精確角色和途徑仍然是主要難W捉摸的。最近，已經(jīng)可能整合形成一條運(yùn)樣的途徑I'2,即 Ca2+流入在實(shí)現(xiàn)穿過G1/S轉(zhuǎn)變或限制點(diǎn)（細(xì)胞周期進(jìn)展中的一個生長因子驅(qū)動的單向步 驟）中的作用。G1/S轉(zhuǎn)變的作用是整合來自許多基礎(chǔ)細(xì)胞輸入的信息，包括生長因子信號 傳遞和營養(yǎng)物可用性。該限制點(diǎn)是對于癌癥表型而言是中屯、性的，因為在G1至S轉(zhuǎn)變中許 多關(guān)鍵蛋白中的遺傳變化或表現(xiàn)遺傳變化可能允許細(xì)胞獨(dú)立于促有絲分裂刺激而增生3。 大量努力已經(jīng)聚焦于祀向細(xì)胞周期激酶來抑制細(xì)胞周期中的G1/S和其它轉(zhuǎn)變點(diǎn)的調(diào)節(jié)異 常3。但是，Ca2+流入是G1/S限制點(diǎn)之后的、生長因子驅(qū)動的轉(zhuǎn)變的途徑的一個中屯、元件， 沒有研究能夠鑒定對該事件的獲得性獨(dú)立一一可能因為與從限制釋放成為一體的Ca2+依 賴性的過程的數(shù)目。
[0005] 巧是許多細(xì)胞過程的關(guān)鍵性調(diào)節(jié)劑，且因此，它的流入受到嚴(yán)格控制。W非常一般 的方式，該調(diào)節(jié)可W是電調(diào)節(jié)或生化調(diào)節(jié)。電控制是運(yùn)些要描述的調(diào)節(jié)機(jī)制中的第一種， 并且在化dgkin和化xl巧的先驅(qū)工作中進(jìn)行了描述化uxl巧和化dgkin，J.化ysiol. 1 : 424-544(1952)。在該調(diào)節(jié)形式中，Ca2+通道被打開W接納化2+，并隨后響應(yīng)于膜電位的變化 而關(guān)閉。該"口控"的細(xì)節(jié)可W被生化事件（諸如蛋白激酶A的活化4或巧調(diào)蛋白5)改變， 但是主要的調(diào)節(jié)事件是膜電位的改變，最特別是動作電位的改變。
[0006] 細(xì)胞內(nèi)巧調(diào)節(jié)是調(diào)節(jié)細(xì)胞周期轉(zhuǎn)變和細(xì)胞調(diào)亡的多個信號傳遞途徑的重要元件。 癌細(xì)胞能夠進(jìn)展穿過細(xì)胞周期和繞過正常的巧介導(dǎo)的檢驗點(diǎn)，從而指示癌細(xì)胞已經(jīng)發(fā)展出 替代機(jī)制來調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)巧。癌細(xì)胞表達(dá)T-型巧通道的新證據(jù)提示，運(yùn)些通道在檢驗點(diǎn)非依 賴性的細(xì)胞周期進(jìn)展和細(xì)胞增生中起作用（TaylorJT等人，WorldJ.Gastroenterol. 14: 4984-4991,2008)〇
[0007] 濃度高于細(xì)胞外部的帶正電荷的離子（諸如鋼、鐘和巧離子）在細(xì)胞內(nèi)空間中的 存在會建立膜電位。細(xì)胞中的膜電位通常是在-40mV至-80mV的范圍內(nèi)。在電可興奮的細(xì) 胞諸如神經(jīng)元中，主要存在2個膜電位水平：靜息（非激活的）電位和較高的闊電位。在神 經(jīng)元中，靜息電位是約-70毫伏（mV)，且闊電位是約-55mV。神經(jīng)元的突觸刺激會造成膜電 位除極化（升高）或超極化（下降）。動作電位是細(xì)胞的電學(xué)膜電位的短暫"波峰"。當(dāng)足 夠的除極化積累W使膜電位達(dá)到闊值時，觸發(fā)動作電位。
[0008] 盡管所有細(xì)胞都具有膜電位，大多數(shù)細(xì)胞不具有分子機(jī)制或細(xì)胞幾何形狀來產(chǎn)生 動作電位。盡管如此，所有細(xì)胞使用細(xì)胞溶質(zhì)Ca2+的增加來調(diào)節(jié)過程諸如分泌或細(xì)胞分裂。 認(rèn)為運(yùn)些細(xì)胞通過內(nèi)部ca2ie存庫（在所謂的電容性的化2+輸入中6)的消耗而啟動化2+ 流入。但是，該機(jī)制可能在細(xì)胞分裂過程中不起作用，且如果運(yùn)樣的話，它與癌癥生物學(xué)或 治療無關(guān) 7。已經(jīng)引入關(guān)于電容途徑的組分的參與的復(fù)雜模型來暗示它們參與調(diào)節(jié)對于細(xì) 胞分裂而言至關(guān)重要的必需Ca2+流入7,但是該途徑在細(xì)胞分裂中的作用仍然不明。已經(jīng)提 出許多離子通道作為Ca2+在其中穿過W實(shí)現(xiàn)G1/S轉(zhuǎn)變的分子途徑8,盡管尚未達(dá)成W下一 致意見：單個途徑在細(xì)胞譜系（不僅僅是細(xì)胞系）中是占優(yōu)勢的。
[0009] 已經(jīng)積累了描述Ca2+通道在電可興奮的細(xì)胞中的調(diào)節(jié)的證據(jù)。也有證據(jù)描繪了 Ca2+輸入在電不可興奮細(xì)胞中的調(diào)節(jié)，但是運(yùn)不可能解釋細(xì)胞分裂所需的化2+的輸入和穿 過G1/S邊界。然后，在癌細(xì)胞和干細(xì)胞中表達(dá)T-型Ca2+通道，但是其是電壓口控的。因為 大多數(shù)類型的癌細(xì)胞和干細(xì)胞不具有被認(rèn)為調(diào)節(jié)運(yùn)樣的電壓口控通道所必需的動作電位， 關(guān)于運(yùn)些通道的功能或調(diào)節(jié)知之甚少。

【發(fā)明內(nèi)容】
陽010] 本公開內(nèi)容提供了化合物，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時，所述化合物抑制細(xì)胞中 的T-型Ca2+通道活性。優(yōu)選的化合物在約-90mV的膜電位W10yM或更小的1C5。抑制T-型Ca2+通道活性。優(yōu)選的化合物對于在約-90mV的膜電位抑制T-型化2+通道活性而言 也是選擇性的，且表現(xiàn)出在約-90mV的T-型Ca2+通道活性抑制相對于在約-30至-60mV的 T-型Ca2+通道活性抑制為10 : 1或更小的選擇性。運(yùn)樣的化合物可用于阻止細(xì)胞增生， 且可W阻止癌細(xì)胞和其它寶生性細(xì)胞的增生，同時幾乎不表現(xiàn)出或不表現(xiàn)出神經(jīng)元活性的 抑制。
[0011] 本公開內(nèi)容進(jìn)一步提供了通過施用有效量的如上所述的化合物來抑制癌細(xì)胞的 增生的方法，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mv時，所述化合物抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+通道活性。 所述癌細(xì)胞可W是任何癌細(xì)胞，諸如上皮癌細(xì)胞或癌干細(xì)胞。在某些實(shí)施方案中，施用的化 合物是米貝拉地爾或TH-1177。
[0012] 本公開內(nèi)容也提供了通過給需要癌癥治療的受試者施用有效量的如上所述的化 合物來治療癌癥的方法，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時，所述化合物抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+ 通道活性。所述癌癥可W是任何癌癥，諸如上皮癌。在某些實(shí)施方案中，施用的化合物是米 貝拉地爾或TH-1177。在另一個實(shí)施方案中，所述受試者是人。
[0013] 本文中還公開了用于治療癌癥的藥物組合物，其至少含有本文中公開的化合物。
[0014] 本公開內(nèi)容進(jìn)一步提供了鑒定化合物的方法，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mv時，所述 化合物抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+通道活性。運(yùn)些方法包括，確定當(dāng)將細(xì)胞膜電位保持在 約-90mV時化合物的抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+通道活性的能力。通過本領(lǐng)域已知的技術(shù)，諸 如膜片箱技術(shù)，可W將膜電位保持在約-90mV。例如，通過確定化合物的阻止生長因子刺激 的巧向細(xì)胞中的輸入的能力，可W確定當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時化合物的抑制細(xì)胞中的 T-型Ca2+通道活性的能力。通過測量細(xì)胞內(nèi)巧水平的增加，諸如通過使用巧敏感的巧光染 料，可W確定巧向細(xì)胞中的輸入。
[0015] 本公開內(nèi)容也提供了一種用于鑒定化合物的方法，所述化合物用于抑制細(xì)胞周期 進(jìn)展穿過Gl/S檢查點(diǎn)、抑制細(xì)胞增生性疾病中的細(xì)胞增生、和/或增強(qiáng)福射和/或化學(xué)治 療劑在治療細(xì)胞增生性疾病中的效力。所述方法包括，當(dāng)將細(xì)胞的第一細(xì)胞膜電位保持在 約-70mV至約-1lOmV范圍內(nèi)的電位時，確定所述化合物抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+通道活性； 和，基于所述確定，鑒定應(yīng)用于抑制細(xì)胞周期進(jìn)展穿過G1/S檢查點(diǎn)、在細(xì)胞增生性疾病中 抑制細(xì)胞增生、和/或增強(qiáng)福射和/或化學(xué)治療劑在治療細(xì)胞增生性疾病中的效力的化合 物。
[0016] 在附圖和下面的描述中闡述了本發(fā)明的一個或多個實(shí)施方案的細(xì)節(jié)。從所述描述 和附圖W及從權(quán)利要求書會明白本發(fā)明的其它特征、目的和優(yōu)點(diǎn)。
【附圖說明】
[0017] 圖1是將生長因子受體活化的Ca2+與導(dǎo)致穿過G1/S限制點(diǎn)的生化級聯(lián)連接的途 徑之一的示意圖。 陽〇1引圖2是生長因子調(diào)節(jié)的T-型Ca2+通道的活化的步驟的簡圖表示。[化21i是細(xì)胞 內(nèi)的Ca2+濃度，且II)是膜電位。
【具體實(shí)施方式】
[0019] 在本公開內(nèi)容中，應(yīng)當(dāng)理解，為了清楚起見在單獨(dú)實(shí)施方案的背景下描述的本發(fā) 明的某些特征還可W在單個實(shí)施方案中組合地提供。相反，為簡潔起見在單個實(shí)施方案的 背景下描述的本發(fā)明的多個特征還可W單獨(dú)地或W任意合適的子組合提供。
[0020] 本公開內(nèi)容提供了癌癥和腫瘤或增生性疾病的治療，其包括抑制T-型Ca2+通道。 發(fā)明人已經(jīng)確定，抑制T-型Ca2+通道活性，特別是通過當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時抑制細(xì) 胞中的T-型Ca2+通道活性，可W阻止腫瘤疾病的進(jìn)展和治療癌癥。
[0021] 本發(fā)明設(shè)及下述發(fā)現(xiàn)：通過抑制在特定膜電位時的應(yīng)答性來抑制電壓口控的 T-型Ca2+通道，可用于治療腫瘤或癌細(xì)胞增生。不同于典型的化療劑，在約-90mV的膜電 位選擇性地抑制T-型Ca2+通道活性的括抗劑可W阻止癌細(xì)胞的增生，并且對免疫系統(tǒng)功能 具有有限的影響或沒有影響。因此，運(yùn)樣的括抗劑的施用在本文中被表示為癌癥的治療。
[0022] 阻斷T型巧通道的化合物可W表現(xiàn)出神經(jīng)元樣活性（其可W用于治療疼痛、癒痛 等）、抗增生性活性（其可W用于治療癌癥等）或偶爾表現(xiàn)出兩種活性。存在幾種可能性來 解釋阻斷T型巧通道的化合物的行為的差異，諸如神經(jīng)元和增生細(xì)胞中的T-型通道之間的 通道（例如，翻譯后修飾）的電位差異。其他人已經(jīng)提示，抗增生化合物在T-型巧通道處 的活性是非主要的且與抗增生機(jī)制無關(guān)；抗增生機(jī)制完全是不同的祀標(biāo)。
[0023] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)將細(xì)胞電位保持在-90mV時，有效的抗增生化合物會W小于 約lOmM的ICs。值阻斷T-型通道。當(dāng)電位是-40mV時W高效能阻斷穿過T型巧通道的巧 輸入的化合物在神經(jīng)元疾病中是有效的。表現(xiàn)出對于抗增生活性的選擇性的化合物優(yōu)選 地是，具有< 10的在-90mV狀態(tài)的ICg。值相對應(yīng)在-40mV狀態(tài)的1CW值的化合物（即，在 約-90mV的ICs。值是在-40mV的1C5。值的10倍或更?。?。
[0024] 米貝拉地爾優(yōu)先阻斷-90mV狀態(tài)，且是抗增生性的。在本文中將具有不同骨架的 其它抗增生化合物ni-1170和氯贓莫齊（chlopimozide)鑒定為表現(xiàn)出類似的選擇性。表 現(xiàn)出有效神經(jīng)元活性且沒有抗增生活性的其它化合物（例如，TTA-A2和MK-8998)表現(xiàn)出 降低的在-90mV相對于在-40mV的選擇性。因此，本公開內(nèi)容包括鑒定當(dāng)細(xì)胞膜電位是 約-90mV時抑制細(xì)胞中的T-型Ca2+通道活性的化合物的方法，W及通過使用該實(shí)驗方案或 它的明顯外延鑒定出抗增生活性的任何化合物。
[00對 "T-型巧通道"或"T-型Ca2+通道"是低電壓活化的離子通道，其具有W下物質(zhì)的 類型的Ca2+選擇性的a1亞基，或具有與W下物質(zhì)類似的活性和/或氨基酸序列同一性： 由CACNA1G基因編碼的化v3. 1，由CACNA1H基因編碼的化v3. 2，或由CACNA11基因編碼 的化v3. 3。在一個實(shí)施方案中，所述T-型Ca2+通道具有由CACNA1H基因編碼的a1亞基 Cav3. 20
[0026] 本文中使用的"抑制"表示活性的減小或阻止。
[0027]"括抗劑"或"抑制劑"會抑制活性或功能。例如，化合物可W如下充當(dāng)括抗劑或抑 制劑：抑制、減小或消除蛋白表達(dá)，或阻止蛋白活性，或阻止蛋白與其它蛋白的相互作用，導(dǎo) 致蛋白介導(dǎo)的功能或信號傳遞的抑制。括抗劑/抑制劑化合物的例子包括抑制T-型化2+ 通道活性的膚、多膚、蛋白、抗體、反義寡核巧酸、RNAi/siRNA、小分子、化學(xué)治療劑、及其片 段、衍生物和類似物。在一個實(shí)施例中，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時，所述化合物W小于約 lOiiM的半數(shù)最大抑制濃度（ICJ抑制T-型Ca2+通道活性。在另一個實(shí)施例中，與當(dāng)細(xì)胞 膜電位是約-30至-60mV時化合物抑制T-型Ca2+通道活性的選擇性相比，當(dāng)細(xì)胞膜電位是 約-90mV時化合物抑制T-型Ca2+通道活性的選擇性是1 : 10或更小。
[0028] 當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mV時，本發(fā)明的示例性化合物W小于約10yM的半數(shù)最大 抑制濃度（ICJ抑制T-型Ca2+通道活性。1C5。是化合物的抑制生物活性的有效性的量度。 確定化合物的ICe。的方法是本領(lǐng)域已知的，且包括功能性括抗劑測定（例如使用劑量響應(yīng) 曲線）或競爭結(jié)合測定（其測量例如化合物的從祀分子置換已知結(jié)合配偶體的能力）。
[0029] 通過本發(fā)明可W抑制的T-型化2+通道的活性包括、但不限于：細(xì)胞的巧攝??；細(xì) 胞內(nèi)巧水平的調(diào)節(jié)和/或介導(dǎo)；細(xì)胞內(nèi)窗電流的調(diào)節(jié)和/或介導(dǎo)；巧信號傳遞途徑的、巧介 導(dǎo)的信號傳遞和/或調(diào)節(jié)；實(shí)現(xiàn)穿過G1/S轉(zhuǎn)變或限制點(diǎn)的通道；實(shí)現(xiàn)細(xì)胞周期進(jìn)展；啟動 和/或維持細(xì)胞生長和增生，特別是過度的或不希望的增生；啟動和/或維持瘤形成和/或 腫瘤生長；和啟動和/或維持血管生成和/或轉(zhuǎn)移。
[0030] 發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)細(xì)胞膜電位是約-90mv時抑制細(xì)胞中的T-型化2+通道活性， 可W優(yōu)先抑制不希望的細(xì)胞增生，諸如癌細(xì)胞增生。
[0031] 本文中使用的術(shù)語"約"和"大約"指示，值包括固有變異（其例如基于用于確定 所述值的方法）或天然存在的變異（諸如在單個細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的靜息或膜電位的變異，或在 不同細(xì)胞之間發(fā)現(xiàn)的靜息或膜電位的變異）。在一個非限制性的實(shí)施方案中，將該術(shù)語定 義為在10%W內(nèi)，在5%w內(nèi)，在1%W內(nèi)，或在0. 5%w內(nèi)。類似地，"約-90mV"的膜電 位可W包括在-80mV至-lOOmV的測量范圍內(nèi)、或在-85mV至-95mV的范圍內(nèi)、或在-89mV 至-91mV的范圍內(nèi)的膜電位。在另一個實(shí)施例中，"約-30至-60mV"的膜電位可W包括 在-20mV至-70mV的范圍內(nèi)、或在-25mV至-65mV的范圍內(nèi)的膜電化且也包括膜電位范圍 諸如約-30mV至-40mV、約-30mV至-50mV、約-30mV至-70mV