、約-40mV至-50mV、約-40mV 至-60mV、約-40mV至-70mV、約-50mV至-60mV、和約-50 至-70mV、W及約-30mV、約-40mV、 約-50mV和約-60mV。
[0032] 術(shù)語"選擇性"和"特異性"在本文中互換地用于表示對一種狀態(tài)或狀況的抑制優(yōu) 先于另一種狀態(tài)或狀況。選擇性或特異性可w是絕對的，指示僅抑制一種狀態(tài)或狀況且不 抑制不同的狀態(tài)或狀況。選擇性或特異性還可W是相對的，指示對一種狀態(tài)或狀況（即，對 于處于一種膜電位的細胞或細胞類型）的某種抑制W及對另一種狀態(tài)或狀況（即，對于處 于不同膜電位的相同細胞或細胞類型）的某種抑制。
[0033] 表現(xiàn)出就抗增生活性而言的選擇性的化合物的例子是運樣的化合物：其具有 10 : 1或更小的在-90mv狀態(tài)的ICw值與在約-40mV狀態(tài)的ICw值之比，即，化合物在 約-90mV的膜電位的ICg。值不超過相同化合物在-30mV至-60mV、或在約-40mV的膜電位的 ICs。值的10倍。例如，用于在-80mV至-90mV的細胞膜電位抑制T-型化2+通道活性的化合 物（諸如米貝拉地爾）的ICs?？蒞是大約1yM，而用于在細胞膜電位是約-30mV至-60mV 時抑制T-型Ca2+通道活性的化合物（諸如米貝拉地爾）的1CW可W是約0. 1yM或更大， 諸如 0. 15yM、0. 2yM、0. 25yM、0. 3yM，直到l.OyM或更大。
[0034] 盡管細胞的膜電位在G1早期是約-30mV，它在G1晚期下降至約-60mV，然后隨著 細胞退出G1并進入S期而快速地下降至約-90myi。就是在此時點，T型巧通道打開W允許 G1/S轉(zhuǎn)變。因而，當(dāng)它們處于約-30mV至-60mV時具有抑制通道的高效能的T-型巧通道阻 滯劑將對進入S期幾乎沒有影響。運樣的化合物的例子是TTA-A2和MK-8998 (參見Kraus 等人，J.Pharmacol.Exp.llier. 335 :409-17 (2010)和美國專利號 7, 875, 636)。運些化合物 具有抑制T-型巧通道的高效能，但是對癌細胞的增生幾乎沒有影響或根本沒有影響。因 而，T-型巧通道本身的高效能阻斷不會預(yù)測在癌癥治療中的臨床應(yīng)用。
[003引使用TTA-A2和MK-8998的情形不同于另一種T型巧通道阻滯劑米貝拉地爾的情 形。盡管米貝拉地爾優(yōu)先阻斷約-30mV至-60mV的通道（相對于-90mV)，該優(yōu)先是約10比 1 [Gomora等人，J. F^harmacol. Exp. Ther. 292 :96-103 (2000)]，對于其它化合物卻是約1000 比1 [Kraus等人，J F*ha;rmacol. Exp. Hier. 335 :409-17 (2010)]。該顯著差異反映為米貝拉 地爾的抑制癌細胞增生的能力，如在圖中所示。不同于更有效的阻滯劑MK-8998,米貝拉地 爾的該抑制作用給它賦予在癌癥中具有臨床應(yīng)用的潛力。
[0036] 因而，藥學(xué)試劑的阻斷T型通道本身的效能不會賦予在癌癥治療中的臨床應(yīng)用。 相反，阻斷在約-90mV的T型巧通道的能力是一個關(guān)鍵屬性。此外，在約-30mV至-60mV的 高效能結(jié)合是無關(guān)的，且可W促進藥學(xué)試劑的不希望的作用。
[0037] 因此，當(dāng)細胞膜電位是約-90mV時選擇性地抑制細胞中的T-型Ca2+通道活性的化 合物可W抑制不希望的細胞增生，同時與化合物諸如TTA-A2和MK-8998相比對神經(jīng)元活性 幾乎沒有影響或根本沒有影響。另外，當(dāng)細胞膜電位是約-90mV時選擇性地抑制細胞中的 T-型Ca2+通道活性的化合物可W治療癌細胞增生，同時與其它化療化合物相比對免疫細胞 功能具有極小影響。
[0038]T-型Ca2+通道由小膜除極化活化和滅活，并顯示緩慢的滅活速率。因而，運些通 道在低膜電位可W傳輸除極化電流并介導(dǎo)細胞"窗"電流，所述"窗"電流在低或靜息膜電 位發(fā)生在活化和穩(wěn)態(tài)滅活之間的電壓交疊內(nèi)（TsienRW，等人.Low-voltage-activated T-typeCa化channels，Chester:AdisInternationalLtd，第 1-394 頁，1998;CrunelliV， 等人，J.化ysiol.562 :121-129,2005)。T-型Ca2+通道可W在非受激膜電位或靜息膜電 位維持窗電流，從而允許通過未滅活的通道的一部分傳輸持續(xù)的向內(nèi)巧電流度eanBP， McDonou曲SI，化uron20:825-828,1998)。在非受激或靜息細胞條件下，窗電流的介導(dǎo)允 許T-型Ca2+通道調(diào)節(jié)放電細胞如神經(jīng)元和非興奮性組織二者中的細胞內(nèi)巧水平。
[0039]象所有電壓口控的離子通道一樣，T-型Ca2+通道具有3種主要狀態(tài)，它們是關(guān)閉 的、打開的和滅活的25。簡而言之，電壓口控的通道W特定順序循環(huán)：關(guān)閉、打開、滅活；關(guān) 閉、打開、滅活；等。如在電壓口控的通道中可能預(yù)見到的，運些不同的狀態(tài)可W被實驗造 成的膜電位的變化誘發(fā)。在運些實驗系統(tǒng)中，T-型化2+通道主要在癌細胞的靜息膜電位 (-60mV)被滅活，且主要是關(guān)閉的，且在由Ca2+活化的K+通道的活化所造成的超極化電位 (約-90mV)可被打開。 W40] 已經(jīng)為非源自骨髓的細胞中的電壓口控的T-型Ca2+提供了迄今為止關(guān)于實現(xiàn)G1/ S轉(zhuǎn)變的通用Ca2+輸入途徑的最有力證據(jù)2'9'1°。自從在1992年首次描述癌細胞中的T-型Ca2+通道11，已經(jīng)固定了T-型Ca2+通道的癌細胞中的物理和功能表達的證據(jù)I2。但是，關(guān)于 電壓口控的Ca2+通道在不產(chǎn)生動作電位的細胞（諸如癌細胞）中的重要作用的提示，已經(jīng) 受到懷疑。
[0041] 關(guān)于T-型Ca2+通道設(shè)入的證據(jù)源自幾個系列研究。首先，通過滲入祀向T-型化2+ 通道的干擾RNA來操縱細胞系中的T-型Ca2+通道會通過抑制穿過G1/S邊界而阻斷或減慢 運些細胞的增生"'M。相反，T-型Ca2+通道表達的上調(diào)會增加增生速率1S。另外，來自不同 化學(xué)類別的藥理學(xué)抑制劑會抑制T-型Ca2+通道并通過抑制穿過G1/S邊界而協(xié)調(diào)地阻斷癌 細胞的增生1S。另外，已經(jīng)在多種癌細胞類型中發(fā)現(xiàn)了T-型Ca2+通道同種型化v3. 2 (巧通 道，電壓依賴性的，T-型，a1H亞基）和/或它的5 25剪接變體的mRNAie'"。此外，Cav3. 2 信息的存在或不存在與藥物敏感性具有1 : 1一致性"。
[00創(chuàng) T-型Ca2+通道具有"電調(diào)節(jié)的"或"動作電位調(diào)節(jié)的"活性，因為該通道打開W接納 巧并響應(yīng)于膜電位的變化（特別是響應(yīng)于跨膜動作電位的改變）而關(guān)閉。例如，T-型Ca2+ 通道主要在約-30mV至-60mV的靜息膜電位被滅活，但是在約-90mV的超極化電位被巧活 化的巧調(diào)蛋白（CaM)或被巧調(diào)蛋白活化的蛋白（諸如CaMKII)關(guān)閉且可用于打開。
[0043] T-型Ca2+通道具有"生長因子調(diào)節(jié)的"活性，因為該通道在生長因子信號傳遞W后 打開W接納巧。例如，生長因子（例如，但不限于，膜島素樣生長因子、表皮生長因子、神經(jīng) 生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子和血小板衍生的生長因子）對生長因子受體的活化會開啟信號傳 遞級聯(lián)，該級聯(lián)將T-型Ca2+通道從滅活變?yōu)殛P(guān)閉且可用于打開。該機制還可W被從細胞內(nèi) Ca2+膽存庫（諸如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）釋放化2+的任何試劑（諸如毒胡蘿內(nèi)醋）開啟。
[0044] 因此，T-型Ca2+通道被電調(diào)節(jié)的機制和生長因子調(diào)節(jié)的機制調(diào)節(jié)。例如，生長因 子結(jié)合會導(dǎo)致膜電位的變化，該變化會使T-型Ca2+通道從滅活變?yōu)殛P(guān)閉并可用于打開，如 在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)巧時中。在生長因子誘導(dǎo)的增生過程中誘發(fā)的電壓調(diào)節(jié)精確地描繪了T-型Ca2+ 通道狀態(tài)的獨特低電壓敏感性（顯然不同于高電壓活化的L、N、P、R和Q型Ca2+通道）。因 而，在癌癥和干細胞的G1/S轉(zhuǎn)變過程中，靜息狀態(tài)膜電位和生長因子介導(dǎo)的、活化誘導(dǎo)的 超極化電位與T-型Ca2+通道的電壓依賴性狀態(tài)精確地對齊。
[0045] 在W000/059882中公開了抑制T-型Ca2+通道活性的示例性化合物，其內(nèi)容特此通 過引用整體并入。
[0046] 在一個特定實施方案中，T-型Ca2+通道活性的抑制劑是TH-1177,其具有如在W0 00/59882中公開的通式。
[0047]
W48] 另外的T-型Ca2+通道活性抑制劑的例子包括、但不限于米貝拉地爾 (mibefradil)、節(jié)普地爾化巧ridil)、克侖硫卓klentiazem)、地爾硫卓（diltiazem)、 芬地林（fendiline)、戈洛帕米（gallopamil)、普尼拉明（pren}damine)、司莫地爾 (semotiadil)、特羅地林（terodiline)、維拉帕米（verapamil)、氨氯地平（amlodipine)、 阿雷地平（aranidipine)、己尼地平化arnidipine)、貝尼地平化enidipine)、西 尼地平（cilnidipine)、依福地平（efonidipine)、依高地平（elgodipine)、非洛 地平（felodipine)、伊拉地平（isradipine)、拉西地平（lacidipine)、樂卡地 平（lercanidipine)、馬尼地平（manidipine)、尼卡地平（nicardipine)、硝苯 地平（nifedipine)、尼伐地平（nilvadipine)、尼莫地平（nimodipine)、尼索地 平（nisoldipine)、尼群地平（nitrendipine)、桂利嗦（cinnarizine)、氣桂利嗦 (flunarizine)、利多氣嗦（lidoflazine)、洛美利嗦（lomerizine)、節(jié)環(huán)燒化en巧clane)、 依他苯酬（etafenone)、泛托法隆（fantofarone)和贓克昔林（perhexyline)。在一個優(yōu)選 實施例中，生長因子調(diào)節(jié)的T-型Ca2+通道活性抑制劑是米貝拉地爾或TH-1177。 W例當(dāng)細胞膜電位是約-90mV時，化合物諸如米貝拉地爾或TH-1177會抑制T-型Ca2+ 通道活性。類似地，當(dāng)細胞膜電位是約-90mV時，結(jié)合被米貝拉地爾或TH-1177占據(jù)的位點 的試劑可W抑制細胞中的T-型Ca2+通道活性。
[0050] 本公開內(nèi)容進一步提供了鑒定當(dāng)細胞膜電位是約-90mV時抑制細胞中的T-型Ca2+ 通道活性的化合物的方法。通過使用標(biāo)準(zhǔn)的電生理學(xué)方法（諸如膜片箱）測量細胞中T-型 Ca2+通道活性的抑制，或通過測量當(dāng)細胞被促分裂原（諸如生長因子）刺激時藥學(xué)試劑的 阻斷向該細胞（諸如癌細胞）中的巧輸入的能力，可W鑒定運樣的化合物。運樣的方法公 開在，例如，06郵111〇'6，等人，陽85 16的.312:161-164(1992);化￥6^1山4，等人，]\1〇1.81〇1. Cell4:173-184 (1993);和Gomora等人，J.Pharmacol.Exp.llier. 292 :96-103 (2000)，它們 的內(nèi)容通過引用并入。通過方法諸如Ca2+敏感的巧光染料的細胞內(nèi)捕集，可W確定巧輸入。
[0051] 因此，本公開內(nèi)容包括，通過確定化合物在細胞膜電位是約-90mV時抑制細胞中 的T-型Ca2+通道活性的能力來鑒定具有抗增生活性和/或治療癌癥的能力的化合物的方 法。本公開內(nèi)容進一步包括通過本文中公開的方法鑒定的化合物。
[0052] 本文中使用的"腫瘤"細胞或"癌"細胞是指表現(xiàn)出失控增生和侵入周圍組織的潛 力的異常細胞。
[0053] 本文中使用的術(shù)語"癌干細胞"表示運樣的細胞：其可W是高增生性的癌細胞的祖 先，或產(chǎn)生高增生性的癌細胞的祖先。癌干細胞具有重新生長成腫瘤的能力，如它的w下能 力所證實的：在免疫受損的哺乳動物（諸如小鼠）中形成腫瘤，和在免疫受損的哺乳動物 (諸如小鼠）中隨后系列移植后形成腫瘤。
[0054] 本文中公開的化合物可W抑制腫瘤或癌細胞的增生、分化或發(fā)展。通過給有此需 要的受試者施用治療有效量的本文中公開的T-型Ca2+通道活性的抑制劑，可W預(yù)防、治療 和/或控制癌癥或腫瘤疾病，包括、但不限于寶生物、腫瘤、轉(zhuǎn)移灶、白血病或W失控的細胞 生長為特征的任何病癥或疾病。
[0055] 根據(jù)本發(fā)明可W預(yù)防、治療和/或控制任何類型的癌癥。根據(jù)本發(fā)明可W預(yù)防、 治療和/或控制的癌癥的非限制性例子包括上皮起源的癌癥，諸如乳腺癌、基底細胞癌、腺 癌、胃腸癌、唇癌、日腔癌、食管癌、小腸癌和胃癌、結(jié)腸癌、肝癌、膀脫癌、膜腺癌、卵巢癌、宮 頸癌、肺癌、乳腺癌和皮膚癌（諸如鱗狀細胞癌和基底細胞癌）、前列腺癌、腎細胞癌和影響 遍布于身體的上皮細胞的其它已知癌癥。
[0056] 本文提供的治療方法和組合物進一步可用于抑制干細胞（諸如癌干細胞）的增 生。
[0057] T-型Ca2+通道在G1/S轉(zhuǎn)變中的重要作用不限于癌細胞增生。胚胎干細胞也含有 在G1/S轉(zhuǎn)變處增加的化v3. 2信息，Cav3. 2的藥理學(xué)抑制劑會阻斷它們的增生，并且針對 化v3. 2的干擾RNA會降低表征早期干細胞的堿性憐酸酶和0ct3/4表達1S。從表面上看，運 些數(shù)據(jù)表明化v3. 2的表達對于干細胞中的細胞周期進展而言是關(guān)鍵性的。關(guān)于胚胎干細 胞的數(shù)據(jù)另外提示，T-型Ca2+通道水平設(shè)入維持它們的未分化狀態(tài)"。但是，還已經(jīng)證實， 純合的化v3. 2敲除的小鼠正常發(fā)育，僅表現(xiàn)出異常的冠狀動脈功能和顯著降低的出生重 曰'18 里 〇
[0058]總之，顯而易見，Cav3. 2的功能（通常是細胞周期進展和胚胎細胞自我更新所必