蝦夷扇貝毒素ytx純品的提取、制備方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明制備的YTX樣品，可用于制作YTX毒素標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定海洋食品(魚(yú)、蝦、貝等)中蝦夷扇貝毒素YTX的含量，屬于海洋食品安全領(lǐng)域必須要檢測(cè)的指標(biāo)之一。
【背景技術(shù)】
[0002]已有技術(shù)中，有國(guó)外文獻(xiàn)報(bào)道過(guò)針對(duì)YTX毒素的研究，主要用于YTX毒素的研究，結(jié)構(gòu)的表征，YTX毒素的衍生物的化學(xué)結(jié)構(gòu)測(cè)定，YTX產(chǎn)毒環(huán)境與產(chǎn)毒的關(guān)系。國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)未見(jiàn)對(duì)YTX毒素化學(xué)分子結(jié)構(gòu)和性質(zhì)的具體研究。
[0003]YTX標(biāo)準(zhǔn)品的制備，要求所得到的YTX產(chǎn)品必須有一定的產(chǎn)量，同時(shí)純度達(dá)到一定的要求。目前的報(bào)道中，YTX的提取主要用于性質(zhì)分析，提取出的量很小，且純度不高，無(wú)法滿足制備YTX檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)品的需求。同時(shí)，現(xiàn)有文獻(xiàn)沒(méi)有涉及到Y(jié)TX提純的具體步驟及方法，無(wú)法滿足制備YTX標(biāo)準(zhǔn)品的需要。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，YTX樣品可用于制作YTX毒素標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定海洋食品(魚(yú)、蝦、貝等)中蝦夷扇貝毒素YTX的含量，屬于海洋食品安全領(lǐng)域必須要檢測(cè)的指標(biāo)之一。在我國(guó)食品安全，海洋產(chǎn)品出口等問(wèn)題上具有重大的意義。
[0005]本發(fā)明的技術(shù)方案是這樣實(shí)現(xiàn)的:蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，步驟如下:
1)甲醇粗提
向裝有藻糕的離心管中加入甲醇，超聲萃取，離心，收集上清液并過(guò)濾；將濾液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈，量體積并放置于-80°C冰箱保存，備用；
2)經(jīng)過(guò)兩次分離提取 YTX粗分離:
使用2.4X 32cm層析柱，以70g堿性氧化鋁作為填料，CHCl3 - MeOH作為初始洗脫劑洗脫，然后進(jìn)行梯度洗脫，依次加入150ml的CHCl3 - MeOH, 150ml的Me0H，Me0H - 1%氨水洗脫，收集MeOH - 1%氨水部分，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液；將上述洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈為止，然后將溶解液過(guò)濾，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用；
YTX純化:
使用2.4X 32cm層析柱，以60g C18作為填料，30%Me0H水溶液作為初始洗脫劑洗脫，然后進(jìn)行梯度洗脫，依次用250ml的30%Me0H水溶液，140ml的40%Me0H水溶液，140ml的50%Me0H水溶液，140ml的60%Me0H水溶液，250ml的MeOH，梯度沖洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液，將上述收集液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈為止，將溶解液過(guò)濾，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用；
3)YTX純品制備
使用半制備液相色譜-紫外光譜聯(lián)用，以甲醇作為洗脫劑，用250mmX 1mm的半制備柱，5um C18作為填料，在273nm處檢測(cè)洗脫液的紫外吸收強(qiáng)度，取3.64min處出峰，保留濾液，重復(fù)多次提取，得到波譜圖上只有一個(gè)單峰，旋蒸干燥，得到固體YTX純品。
[0006]進(jìn)一步地，甲醇粗提過(guò)程中將收集的上清液先于-80°C冰箱放置過(guò)夜，第二天再使用孔徑為0.45um濾膜過(guò)濾提取液，收集濾液。
[0007]進(jìn)一步地，初始洗脫劑洗脫過(guò)程為:用彎頭膠頭滴管，緊貼柱壁轉(zhuǎn)圈上樣3ml，開(kāi)閥，待樣品下移至液面相切時(shí)，用初始洗脫液淋洗柱壁2-3次，每次約1ml，然后進(jìn)行梯度洗脫。
[0008]進(jìn)一步地，旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗時(shí)，用彎頭膠頭滴管從平底旋轉(zhuǎn)整瓶的瓶勁處不斷淋洗。
[0009]進(jìn)一步地，純品制備過(guò)程中，重復(fù)多次提取，把純化后收集液全部提取完成，合并取得濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2ml ;濃縮后的濾液再次提取，并小心提取3.64min處出峰，合并所提取濾液，得到Y(jié)TX純化產(chǎn)品；將YTX純化產(chǎn)品旋蒸濃縮，得到波譜圖上只有一個(gè)單峰，旋蒸干燥，得到固體YTX純品。
[0010]進(jìn)一步地，兩次分離提取最后溶解液過(guò)濾均使用孔徑為0.22 μ m的濾膜。
[0011]本發(fā)明的有益效果為:本發(fā)明蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)對(duì)于貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的空白，極大的促進(jìn)了國(guó)內(nèi)貝類毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和海洋食品安全的工作，對(duì)于國(guó)內(nèi)海產(chǎn)品順利出口到歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家，有著很大的促進(jìn)作用。
【附圖說(shuō)明】
[0012]圖1純品制備過(guò)程檢測(cè)一色譜分離波譜圖。
[0013]圖2純品制備過(guò)程檢測(cè)二色譜分離波譜圖圖3純品檢測(cè)色譜分離波譜圖。
【具體實(shí)施方式】
[0014]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步解釋說(shuō)明。
[0015]一、甲醇粗提
1.向裝有0.5g藻糕的50mL離心管中加入適量的甲醇，用玻璃棒攪勻，超聲萃取15min，3500r/min,離心lOmin，收集上清液，向殘?jiān)屑尤脒m量甲醇，反復(fù)離心、收集上清液3次。將全部所得上清液于-80°C冰箱放置過(guò)夜，第二天使用孔徑為0.45um濾膜過(guò)濾提取液，收集濾液。
[0016]2.將上述過(guò)濾液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(100rpm/min，，40°C)，蒸干后，分3次，加入12 ml甲醇，使用彎頭膠頭滴管從平底旋蒸瓶(25mL)瓶頸處不斷淋洗，然后超聲，直至瓶壁上的溶質(zhì)溶解干凈為止，量體積并放置于-80°C冰箱保存，備用。
[0017]二、兩次分離提取 YTX粗分離
3.使用2.4X 32cm層析柱，以70g堿性氧化鋁作為填料，CHCl3-MeOH (1:1)作為初始洗脫劑，粗分離YTX。用彎頭膠頭滴管，緊貼柱壁轉(zhuǎn)圈上樣3ml，開(kāi)閥，待樣品下移致液面相切時(shí)，用CHCl3 - MeOH (1:1)淋洗柱壁2_3次，每次約lmL，然后進(jìn)行梯度洗脫，依次加入CHCl3 - MeOH (1:1，150 ml)，MeOH (150ml)，MeOH - 1% 氨水洗脫。收集 MeOH - 1% 氨水部分，1ml /管，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液。
[0018]4.將上述收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(100rpm/min，40°C )，蒸干后