，分3次，加入12ml甲醇，使用彎頭膠頭滴管從平底旋蒸瓶(25ml)瓶頸處不斷淋洗，然后超聲，直至瓶壁上的溶質(zhì)溶解干凈為止，將溶解液過(guò)0.22 μ m濾膜，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用。
[0019]YTX 純化
5.使用2.4X32cm層析柱，以60g C18作為填料，30%Me0H水溶液作為初始洗脫劑。緊貼柱壁轉(zhuǎn)圈上樣3ml，開(kāi)閥，待樣品下移致液面相切時(shí)，用30%Me0H淋洗柱壁2_3次，每次約ImL,然后進(jìn)行梯度洗脫，依次用30%Me0H水溶液(250ml )，40%Me0H水溶液(140ml )，50%Me0H水溶液(140ml )，60%Me0H水溶液(140ml)，MeOH (250ml)，梯度沖洗柱子。收集MeOH部分，1ml /管，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液。
[0020]6.將上述收集液旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)(100rpm/min，，40°C)，蒸干后，分3次，加入12ml甲醇，使用彎頭膠頭滴管從平底旋蒸瓶(25ml)瓶頸處不斷淋洗，然后超聲，直至瓶壁上的溶質(zhì)溶解干凈為止，將溶解液過(guò)0.22 μ m濾膜，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用。
[0021]三、YTX純品制備
7.使用半制備液相色譜-紫外光譜聯(lián)用，以甲醇作為洗脫劑，用250_X10mm的半制備柱，5um C18作為填料，在273nm處檢測(cè)洗脫液的紫外吸收強(qiáng)度。進(jìn)樣量lOOul，流速4.0ml/min，取3.64min處出峰(如圖1)，保留濾液。重復(fù)次過(guò)程，把步驟6中收集液全部提取完成。合并取得濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2ml。
[0022]8.濃縮后的濾液再次提取，重復(fù)步驟7過(guò)程，并小心提取3.64min處出峰(如圖
2)，合并所提取濾液，得到Y(jié)TX純化產(chǎn)品。
[0023]將YTX純品旋蒸濃縮，利用步驟7過(guò)程檢測(cè)純度，得到波譜圖上只有一個(gè)單峰(如圖3 )，旋蒸干燥，得到固體YTX純品。
[0024]以上所述，僅為本發(fā)明較佳的【具體實(shí)施方式】，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不局限于此，任何熟悉本技術(shù)領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明披露的技術(shù)范圍內(nèi)，根據(jù)本發(fā)明的技術(shù)方案及其發(fā)明構(gòu)思加以等同替換或改變，都應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1.蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，步驟如下: 1)甲醇粗提 向裝有藻糕的離心管中加入甲醇，超聲萃取，離心，收集上清液并過(guò)濾；將濾液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈，量體積并放置于-80°C冰箱保存，備用； 2)經(jīng)過(guò)兩次分離提取 YTX粗分離: 使用2.4X 32cm層析柱，以70g堿性氧化鋁作為填料，CHCl3 - MeOH作為初始洗脫劑洗脫，然后進(jìn)行梯度洗脫，依次加入150ml的CHCl3 - MeOH, 150ml的Me0H，Me0H - 1%氨水洗脫，收集MeOH - 1%氨水部分，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液；將上述洗脫液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈為止，然后將溶解液過(guò)濾，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用； YTX純化: 使用2.4X 32cm層析柱，以60g C18作為填料，30%Me0H水溶液作為初始洗脫劑洗脫，然后進(jìn)行梯度洗脫，依次用250ml的30%Me0H水溶液，140ml的40%Me0H水溶液，140ml的50%Me0H水溶液，140ml的60%Me0H水溶液，250ml的MeOH，梯度沖洗柱子，收集MeOH部分，使用液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜測(cè)其YTX濃度，合并含有YTX的洗脫液，將上述收集液旋轉(zhuǎn)蒸干后加入12ml甲醇淋洗，然后超聲，直至溶質(zhì)溶解干凈為止，將溶解液過(guò)濾，置于玻璃瓶中，于-80°C冰箱保存，備用； 3)YTX純品制備 使用半制備液相色譜-紫外光譜聯(lián)用，以甲醇作為洗脫劑，用250mmX 1mm的半制備柱，5 μ m C18作為填料，在273nm處檢測(cè)洗脫液的紫外吸收強(qiáng)度，取3.64min處出峰，保留濾液，重復(fù)多次提取，得到波譜圖上只有一個(gè)單峰，旋蒸干燥，得到固體YTX純品。2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，甲醇粗提過(guò)程中將收集的上清液先于-80°C冰箱放置過(guò)夜，第二天再使用孔徑為0.45 μ m濾膜過(guò)濾提取液，收集濾液。3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，初始洗脫劑洗脫過(guò)程為:用彎頭膠頭滴管，緊貼柱壁轉(zhuǎn)圈上樣3ml，開(kāi)閥，待樣品下移至液面相切時(shí)，用初始洗脫液淋洗柱壁2-3次，每次約1ml，然后進(jìn)行梯度洗脫。4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，旋轉(zhuǎn)蒸干后加入甲醇淋洗時(shí)，用彎頭膠頭滴管從平底旋轉(zhuǎn)整瓶的瓶勁處不斷淋洗。5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，YTX純品制備過(guò)程中，重復(fù)多次提取，把純化后收集液全部提取完成，合并取得濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至2ml ;濃縮后的濾液再次提取，并提取3.64min處出峰，合并所提取濾液，得到Y(jié)TX純化產(chǎn)品^_ΥΤΧ純化產(chǎn)品旋蒸濃縮，得到波譜圖上只有一個(gè)單峰，旋蒸干燥，得到固體YTX純品O6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，其特征在于，兩次分離提取最后溶解液過(guò)濾均使用孔徑為0.22 μ m的濾膜。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種蝦夷扇貝毒素YTX純品的提取、制備方法，講過(guò)甲醇粗提、兩次YTX分離提取、YTX純品的制備等步驟制備得到Y(jié)TX樣品，可用于制作YTX毒素標(biāo)準(zhǔn)品，測(cè)定海洋食品（魚、蝦、貝等）中蝦夷扇貝毒素YTX的含量，屬于海洋食品安全領(lǐng)域必須要檢測(cè)的指標(biāo)之一。該方法填補(bǔ)了國(guó)內(nèi)對(duì)于貝類毒素標(biāo)準(zhǔn)品缺乏的空白，極大的促進(jìn)了國(guó)內(nèi)貝類毒素檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展和海洋食品安全的工作，對(duì)于國(guó)內(nèi)海產(chǎn)品順利出口到歐盟等發(fā)達(dá)國(guó)家，有著很大的促進(jìn)作用。
【IPC分類】C07D493/22
【公開(kāi)號(hào)】CN105198900
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510605636
【發(fā)明人】楊琳, 梁玉波, 劉仁沿, 劉磊, 許道艷, 李冬梅
【申請(qǐng)人】國(guó)家海洋環(huán)境檢測(cè)中心
【公開(kāi)日】2015年12月30日
【申請(qǐng)日】2015年9月22日