Cers2 基因及其表達(dá)產(chǎn)物作為骨質(zhì)疏松癥的診治靶標(biāo)的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地設(shè)及祀RS2基因在骨質(zhì)疏松癥的診斷、治療中 的用途。
【背景技術(shù)】
[0002] 骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis)是一種系統(tǒng)性骨病，其特征是骨量下降和骨的微細(xì) 結(jié)構(gòu)破壞，表現(xiàn)為骨的脆性增加，因而骨折的危險(xiǎn)性大為增加，即使是輕微的創(chuàng)傷或無外傷 的情況下也容易發(fā)生骨折。常常在不知不覺中發(fā)生椎體壓縮骨折，也可因咳嗽、打噴曖、輕 微外傷等誘發(fā)椎體骨折。骨質(zhì)疏松癥是一種多因素所致的慢性疾病。在骨折發(fā)生之前，通 常無特殊臨床表現(xiàn)。該病女性多于男性，但各年齡時(shí)期均可發(fā)病，常見于絕經(jīng)后婦女和老年 人。隨著我國(guó)老年人口的增加，骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率處于上升趨勢(shì)，在我國(guó)乃至全球都是一個(gè) 值得關(guān)注的健康問題。
[0003] 骨質(zhì)疏松的危害性主要在于其所引起的骨折，可發(fā)生于全身任何部位，最常見于 腰椎、髓關(guān)節(jié)部位和榜骨。1999年調(diào)查發(fā)現(xiàn)，中國(guó)60歲W上骨質(zhì)疏松患病率，腰椎2~4 : 男女分別11 %和21 %;股骨頸：分別為11 %和27%。絕經(jīng)后婦女的1/3~1/2存在骨質(zhì)疏 松癥。在美國(guó)，該病每年約使150萬人發(fā)生骨折，與此有關(guān)的醫(yī)療費(fèi)用超過100億美元。年 逾65歲的婦女中1/3將發(fā)生椎骨骨折，年齡更大時(shí)，1/3的女性和1/6的男性將發(fā)生髓部骨 折，其中20%死于骨折所致的各種并發(fā)癥，另有30%需要長(zhǎng)期的家庭護(hù)理。雖然我國(guó)目前 尚缺乏骨質(zhì)疏松并有骨折的確切發(fā)生率資料，但由于老年人口眾多，估計(jì)相當(dāng)可觀。骨質(zhì)疏 松癥在中國(guó)同樣不僅是一個(gè)醫(yī)療問題，也是一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生和社會(huì)問題。
[0004] 骨質(zhì)疏松癥的檢測(cè)包括實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)的檢測(cè)和輔助檢測(cè)。
[0005] 實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)：
[0006] 骨質(zhì)疏松癥患者部分血清學(xué)生化指標(biāo)可W反應(yīng)骨轉(zhuǎn)換（包括骨形成和骨吸收） 狀態(tài)，在骨的高轉(zhuǎn)換狀態(tài)（例如I型骨質(zhì)疏松癥）下，運(yùn)些指標(biāo)可W升高，也可用于監(jiān)測(cè) 治療的早期反應(yīng)。但其在骨質(zhì)疏松癥中的臨床意義仍有待于進(jìn)一步研究。運(yùn)些生化測(cè)量 指標(biāo)包括：骨特異的堿性憐酸酶度one-specifica化aline地OS地atase，反應(yīng)骨形成）、 抗酒石酸酸性憐酸酶（tartratedresistantacidphosphatse，反應(yīng)骨吸收）、骨巧素 (Osteocalcin,反應(yīng)骨形成）、1型原膠原膚（TypeIprocollage噸eptidase，反應(yīng)骨形 成）、尿化晚嘟（Urinarypyridinoline)和脫氧[I比晚嘟（Urinarydeoxypyridinoline，反 應(yīng)骨吸收）、I型膠原的N-C-末端交聯(lián)膚（cross-linkedN-andC-telopeptideoftype Icollagen,反應(yīng)骨吸收）。正如前面所提到的，使用生化指標(biāo)檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥的精確度不 夠。
[0007] 輔助檢查：包括骨影像學(xué)檢查和骨密度檢測(cè)。輔助檢查的對(duì)象一般都是骨質(zhì)疏松 癥的晚期患者，不能用于早期骨質(zhì)疏松癥患者的篩查。
[0008] 基于現(xiàn)有技術(shù)中檢測(cè)骨質(zhì)疏松癥的手段的局限性，尋找一種有效的能夠在早期即 可診斷骨質(zhì)疏松癥發(fā)生的方法是亟待解決的問題。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 為了彌補(bǔ)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種可用于骨質(zhì)疏松癥 (Osterart虹itis，0A)早期診斷的分子標(biāo)志物。相比傳統(tǒng)的骨質(zhì)疏松癥的診斷方法，使用 基因標(biāo)志物來診斷骨質(zhì)疏松癥的具有及時(shí)性、特異性和靈敏性，從而使患者在疾病早期就 能知曉疾病風(fēng)險(xiǎn)，針對(duì)風(fēng)險(xiǎn)高低，采取相應(yīng)的預(yù)防和治療措施。
[0010] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
[0011] 本發(fā)明提供了檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷骨質(zhì)疏松癥的工具中的應(yīng) 用。
[0012] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括檢測(cè)CERS2基因mRNA水平的產(chǎn)品、 和/或檢測(cè)CERS2蛋白水平的產(chǎn)品。
[0013] 進(jìn)一步，所述檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢 巧。、原位雜交或忍片檢測(cè)祀RS2基因表達(dá)W診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品。
[0014] 進(jìn)一步，所述用RT-PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增CERS2基因 的引物；所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品至少包括一對(duì)特異擴(kuò)增CERS2基因的 引物；所述用免疫檢測(cè)診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：與CERS2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述 用原位雜交診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：與Cm?S2基因的核酸序列雜交的探針；所述用忍 片診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：蛋白忍片和基因忍片；其中，蛋白忍片包括與祀RS2蛋白特 異性結(jié)合的抗體，基因忍片包括與祀RS2基因的核酸序列雜交的探針。
[0015] 所述用實(shí)時(shí)定量PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品至少包括的一對(duì)特異擴(kuò)增CERS2基因 的引物如沈QIDNO. 3和沈QIDNO. 4所示。
[0016] 所述檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的產(chǎn)品可W是檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的試劑、也可W是包 含所述試劑的試劑盒、忍片、試紙等，也可W是使用所述試劑的高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0017] 所述診斷骨質(zhì)疏松癥的工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平 臺(tái)；高通量測(cè)序平臺(tái)是一種特殊的診斷骨質(zhì)疏松癥的工具，隨著高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，對(duì) 一個(gè)人的基因表達(dá)譜的構(gòu)建將成為十分便捷的工作。通過對(duì)比疾病患者和正常人群的基因 表達(dá)譜，容易分析出哪個(gè)基因的異常與疾病相關(guān)。因此，在高通量測(cè)序中獲知祀RS2基因的 異常與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)也屬于祀RS2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
[0018] 本發(fā)明還提供了一種診斷骨質(zhì)疏松癥的工具，所述工具包括檢測(cè)祀RS2基因表達(dá) 的試劑；所述試劑包括檢測(cè)CERS2基因mRNA的引物和/或探針、檢測(cè)CERS2蛋白的抗體。
[0019] 所述工具包括但不限于忍片、試劑盒、試紙、或高通量測(cè)序平臺(tái)。
[0020] 其中，所述忍片包括基因忍片、蛋白質(zhì)忍片；所述基因忍片包括固相載體W及固定 在固相載體的寡核巧酸探針，所述寡核巧酸探針包括用于檢測(cè)祀RS2基因轉(zhuǎn)錄水平的針對(duì) (ERS2基因的寡核巧酸探針；所述蛋白質(zhì)忍片包括固相載體W及固定在固相載體的CERS2 蛋白的特異性抗體；所述基因忍片可用于檢測(cè)包括祀RS2基因在內(nèi)的多個(gè)基因（例如，與骨 質(zhì)疏松癥相關(guān)的多個(gè)基因）的表達(dá)水平。所述蛋白質(zhì)忍片可用于檢測(cè)包括祀RS2蛋白在內(nèi) 的多個(gè)蛋白質(zhì)（例如與骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的多個(gè)蛋白質(zhì)）的表達(dá)水平。通過將多個(gè)與骨質(zhì)疏 松癥的標(biāo)志物同時(shí)檢測(cè)，可大大提高骨質(zhì)疏松癥診斷的準(zhǔn)確率。
[0021] 其中，所述試劑盒包括基因檢測(cè)試劑盒和蛋白免疫檢測(cè)試劑盒；所述基因檢測(cè)試 劑盒包括用于檢測(cè)祀RS2基因轉(zhuǎn)錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測(cè)試劑盒包括(ERS2蛋白 的特異性抗體。進(jìn)一步，所述試劑包括使用RT-PCR、實(shí)時(shí)定量PCR、免疫檢測(cè)、原位雜交或忍 片方法檢測(cè)祀RS2基因表達(dá)水平過程中所需的試劑。優(yōu)選度，所述試劑包括針對(duì)(ERS2基 因的引物和/或探針。根據(jù)祀RS2基因的核巧酸序列信息容易設(shè)計(jì)出可W用于檢測(cè)CERS2 基因表達(dá)水平的引物和探針。
[0022] 所述試紙包括檢測(cè)CERS2基因表達(dá)的試劑。
[0023] 所述高通量測(cè)序平臺(tái)包括檢測(cè)C邸S2基因表達(dá)的試劑。
[0024] 與CERS2基因的核酸序列雜交的探針可W是DNA、RNA、DNA-RNA嵌合體、PNA或其 它衍生物。所述探針的長(zhǎng)度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核巧酸序列特異性結(jié) 合，任何長(zhǎng)度都可W。所述探針的長(zhǎng)度可短至25、20、15、13或10個(gè)堿基長(zhǎng)度。同樣，所述 探針的長(zhǎng)度可長(zhǎng)至60、80、100、150、300個(gè)堿基對(duì)或更長(zhǎng)，甚至整個(gè)基因。由于不同的探針 長(zhǎng)度對(duì)雜交效率、信號(hào)特異性有不同的影響，所述探針的長(zhǎng)度通常至少是14個(gè)堿基對(duì)，最 長(zhǎng)一般不超過30個(gè)堿基對(duì)，與目的核巧酸序列互補(bǔ)的長(zhǎng)度W15-25個(gè)堿基對(duì)最佳。所述探 針自身互補(bǔ)序列最好少于4個(gè)堿基對(duì)，W免影響雜交效率。
[0025] 進(jìn)一步，所述C邸S2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述CERS2 蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修