121] 表1PCR反應(yīng)體系
[0122]
[0123]
[0124] (3)PCR反應(yīng)條件：95°C12min，（95°C15s，60°C50s)*42 個循環(huán)。WSYBRGreen 作為巧光標(biāo)記物，在Li曲t切cler巧光定量PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，通過融解曲線分析和 電泳確定目的條帶，AACT法進(jìn)行相對定量。
[01巧]2. 4統(tǒng)計學(xué)方法
[0126] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，干擾(ERS2基因表達(dá)組與對照組之間的差 異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0. 05時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0127] 2. 5 結(jié)果
[012引結(jié)果如圖3所示，與siRNA2-CERS2、siRNA3-CERS2相比，siRNAl-CERS2能夠更有 效的抑制CERS2基因的表達(dá)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0. 05)，使用siRNAl-CERS2進(jìn)行后續(xù) 的實(shí)驗(yàn)。
[0129] 3、Western blot實(shí)驗(yàn)檢測siRNAl-CERS2的干擾效率
[0130] 步驟同實(shí)施例2。
[0131] 結(jié)果如圖4所示，與轉(zhuǎn)染siRNA-NC組相比，轉(zhuǎn)染siRNAl-CERS2的細(xì)胞中CERS2蛋 白的含量明顯降低，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<〇. 05)。
[0132] 實(shí)施例4CERS2基因的表達(dá)對成骨細(xì)胞增殖能力的測定
[0133] 使用Cell Countingkit-8 (cck-8)試劑盒用于檢測成骨細(xì)胞增殖的檢測
[0134] 1、步驟
[0135] 按照前面實(shí)施例的方法進(jìn)行成骨細(xì)胞的培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染，細(xì)胞分為=個實(shí)驗(yàn)組：
[0136] 組1:正常骨密度組織來源的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-NC(正常+siRNA-NC);
[0137] 組2:骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染SiRNA-NC(骨質(zhì)疏松+siRNA-NC);
[0138] 組3:骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞轉(zhuǎn)染siRNA-CERS2(骨質(zhì)疏松+siRNA-CERS2)
[0139]轉(zhuǎn)染24h后，W2XlOVml密度接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每個實(shí)驗(yàn)組設(shè)計S復(fù) 孔，每孔100y1，放置于37°C、5 %C〇2培養(yǎng)箱中解育，24h細(xì)胞貼壁后，分別在所需檢測的培 養(yǎng)孔內(nèi)每孔加入10y1CK-8溶液，在細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)解育Ih，測定450nm處各孔吸光度 值伽值）
[0140] 2、統(tǒng)計學(xué)方法
[0141] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0. 05 時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0142] 3、結(jié)果
[0143] 結(jié)果如表2所示，與正常骨密度人相比，骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞增殖緩慢，骨質(zhì) 疏松患者干擾CERS2基因表達(dá)后，成骨細(xì)胞的增殖加快，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0. 05)。上 述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CERS2基因表達(dá)抑制了骨質(zhì)疏松患者成骨細(xì)胞的增殖，使用抑制CERS2基 因表達(dá)的試劑后成骨細(xì)胞的增殖抑制作用解除。
[0144] 表2成骨細(xì)胞0D值
[0145]
[0146] 實(shí)施例5成骨細(xì)胞抗體中和實(shí)驗(yàn)
[0147] 1、步驟：
[014引將成骨細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔2xl03cells/孔/200y1，細(xì)胞貼壁后 進(jìn)行如下處理：
[0149] 實(shí)驗(yàn)組1:正常骨密度組織來源的成骨細(xì)胞中加入無關(guān)單抗（1:30)，作為對照組；
[0150] 實(shí)驗(yàn)組2:骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞中加入無關(guān)單抗（1:30)(骨質(zhì)疏松+無關(guān)單 抗）；
[0151] 實(shí)驗(yàn)組3:骨質(zhì)疏松患者的成骨細(xì)胞中加入抗人CERS2單抗（1:30)(骨質(zhì)疏松 +CERS2 單抗）
[0152] 將細(xì)胞在37°C、5 %C〇2培養(yǎng)箱解育24小時后，加入3H-TdR(1yCi/孔），再培養(yǎng)24 小時，收集細(xì)胞，加液體閃爍液，P計數(shù)儀檢測cpm值。
[0153] 2、統(tǒng)計學(xué)方法
[0154] 實(shí)驗(yàn)都是按照重復(fù)3次來完成的，結(jié)果數(shù)據(jù)都是W平均值+標(biāo)準(zhǔn)差的方式來表 示，采用SPSS13. 0統(tǒng)計軟件來進(jìn)行統(tǒng)計分析的，兩者之間的差異采用t檢驗(yàn)，認(rèn)為當(dāng)P<0. 05 時具有統(tǒng)計學(xué)意義。
[0155] 3、結(jié)果
[0156] 結(jié)果如圖5所示，相比于對照組，（骨質(zhì)疏松+無關(guān)單抗）組細(xì)胞增殖變慢，而加 入CERS2單抗的（骨質(zhì)疏松+CERS2單抗）組細(xì)胞的增殖得到了恢復(fù)。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明， 抑制CERS2蛋白的功能可W促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖。
[0157] 上述實(shí)施例的說明只是用于理解本發(fā)明的方法及其核屯、思想。應(yīng)當(dāng)指出，對于本 領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可w對本發(fā)明進(jìn)行若干改進(jìn) 和修飾，運(yùn)些改進(jìn)和修飾也將落入本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 檢測CERS2基因表達(dá)的產(chǎn)品在制備診斷骨質(zhì)疏松癥的工具中的應(yīng)用。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的應(yīng)用，其特征在于，所述產(chǎn)品包括：通過RT-PCR、實(shí)時定量 PCR、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測CERS2基因表達(dá)以診斷骨質(zhì)疏松癥 的產(chǎn)品；所述用RT-PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CERS2基因的引物； 所述用實(shí)時定量PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品至少包括一對特異擴(kuò)增CERS2基因的引物；所 述用免疫檢測診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：與CERS2蛋白特異性結(jié)合的抗體；所述用原位 雜交診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：與CERS2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷 骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn)品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與CERS2蛋白特異性結(jié) 合的抗體，基因芯片包括與CERS2基因的核酸序列雜交的探針。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于，所述用實(shí)時定量PCR診斷骨質(zhì)疏松癥的產(chǎn) 品至少包括的一對特異擴(kuò)增CERS2基因的引物如SEQIDNO. 3和SEQIDNO. 4所示。4. 一種診斷骨質(zhì)疏松癥的工具，其特征在于，所述工具包括檢測CERS2基因表達(dá)的試 劑；所述試劑包括檢測CERS2基因mRNA的引物和/或探針、檢測CERS2蛋白的抗體。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的工具，其特征在于，所述檢測CERS2基因mRNA的引物包括SEQ IDNO. 3和SEQIDNO. 4所示的引物對。 6. CERS2基因和/或其表達(dá)產(chǎn)物的抑制劑在制備治療骨質(zhì)疏松癥的藥物中的應(yīng)用。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制劑包括抑制CERS2基因表達(dá)的試 劑、和/或抑制CERS2基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述抑制CERS2基因表達(dá)產(chǎn)物的試劑包括 抑制針對CERS2基因的siRNA、和/或CERS2蛋白的抗體。9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述針對CERS2基因的siRNA序列如SEQ IDNO. 7 和SEQIDNO. 8 所示。10. -種用于治療骨質(zhì)疏松癥的藥物組合物，其特征在于，所述藥物組合物包括權(quán)利要 求6-9中任一項(xiàng)所述的抑制劑。
【專利摘要】本發(fā)明公開了CERS2基因及其表達(dá)產(chǎn)物可以作為骨質(zhì)疏松癥診治的分子標(biāo)志物。通過檢測骨組織中CERS2基因及其表達(dá)產(chǎn)物的含量可以判斷受試者是否患有骨質(zhì)疏松癥或者診斷受試者是否存在患有骨質(zhì)疏松癥的風(fēng)險。本發(fā)明通過研究體外培養(yǎng)的成骨細(xì)胞的增殖情況發(fā)現(xiàn)CERS2基因的表達(dá)抑制可以促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖，并且通過抑制CERS2蛋白的功能同樣可以促進(jìn)成骨細(xì)胞的增殖，上述研究結(jié)果表明CERS2基因及其表達(dá)產(chǎn)物是治療骨質(zhì)疏松癥的一個潛在的藥物靶點(diǎn)。
【IPC分類】G01N33/68, C12Q1/68, A61K45/00, A61P19/10
【公開號】CN105200137
【申請?zhí)枴緾N201510629348
【發(fā)明人】李曙光, 楊承剛
【申請人】北京泱深生物信息技術(shù)有限公司
【公開日】2015年12月30日
【申請日】2015年9月28日