經(jīng)il-12/cd62l融合蛋白改造的腫瘤治療劑及其制法和用圖
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地設(shè)及一種經(jīng)IL-12/CD6化融合蛋白改造的腫瘤治療 劑及其制法和用途。本發(fā)明提供了一類IL-12/CD6化基因修飾的、具有增強(qiáng)抗瘤效果的T 細(xì)胞。
【背景技術(shù)】
[0002] 比-12是一種非常重要的免疫刺激因子。比-12是由共價(jià)鍵鏈接的異質(zhì)性二聚體 細(xì)胞因子，由p35和p40亞基組成，在體內(nèi)由激活的免疫細(xì)胞分泌。比-12是重要的細(xì)胞免 疫調(diào)控因子，在抗感染免疫及惡性腫瘤的免疫中通過(guò)NK細(xì)胞W及CTL發(fā)揮作用。
[0003] 先天性缺失IL-12或?qū)L-12不反映的個(gè)體，其抗感染免疫存在嚴(yán)重缺陷。一系 列的臨床前實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ妥C實(shí)，比-12的介入可W顯著地延長(zhǎng)荷瘤動(dòng)物模型的生存期。
[0004] 雖然IL-12具有顯著的抑瘤效果，但是由于其系統(tǒng)性全身給藥會(huì)引起全身性毒副 反應(yīng)，因而受到極大的限制。在本發(fā)明之前，比-12的臨床應(yīng)用由于其所誘導(dǎo)的全身性毒副 作用，W及早期臨床試驗(yàn)通過(guò)全身系統(tǒng)性給藥引起的兩例患者的意外死亡，使其臨床應(yīng)用 受到大大的限制。 陽(yáng)0化]為了避免全身性給藥的毒副作用從而實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用的目的，臨床科研工作者們通 過(guò)腫瘤局部注射、瞬時(shí)表達(dá)及多點(diǎn)注射等途徑應(yīng)用于腫瘤的臨床試驗(yàn)，但是由于IL-12的 治療效果同回輸?shù)腎L-12的劑量直接相關(guān)，上述局部的臨床方案并未有取得顯著的抑瘤效 果。
[0006] 為了解決運(yùn)一問(wèn)題，本發(fā)明人曾經(jīng)試圖通過(guò)基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞持續(xù)分泌 比-12來(lái)實(shí)現(xiàn)抗腫瘤效果的最大化，但是由于未知的原因（一種可能的原因是IL-12的毒 副作用）通過(guò)持續(xù)分泌IL-12方案基因修飾的T細(xì)胞在體外不能有效擴(kuò)增，并引起大量的 T細(xì)胞調(diào)亡。
[0007] 為了解決運(yùn)一問(wèn)題，本發(fā)明人亦通過(guò)TCR活化特異性調(diào)控IL-12的表達(dá)的基因修 飾方案，取得了T細(xì)胞體外有效擴(kuò)增的難題，也取得了一定的抑瘤效果，但同時(shí)存在IL-12 脫離調(diào)控所引發(fā)的毒副作用，無(wú)法有效應(yīng)用于臨床應(yīng)用。
[000引綜上所述，本領(lǐng)域尚缺乏高效且毒副作用不明顯的基于IL-12的抗腫瘤藥物。因 此，本領(lǐng)域迫切需要開(kāi)發(fā)高效且毒副作用低的腫瘤治療藥物。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明目的就是提供了一種高效且毒副作用低的腫瘤治療藥物及其制法和應(yīng)用。
[0010] 在本發(fā)明的第一方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白包括融合在一起的W 下元件： W11]a)任選的位于N端的信號(hào)膚和/或前導(dǎo)膚；
[0012] (ii)第一蛋白元件；
[0013](iii)第二蛋白元件；化及
[0014] (iv)任選的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之間的連接膚元件；
[0015] 其中，所述信號(hào)膚可操作地連于由（ii)、（iii)和（iv)所構(gòu)成的融合元件；
[0016] 并且第一蛋白元件為IL-12蛋白元件；第二蛋白元件為CD62L的蛋白元件。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述的"可操作地連于"指所述信號(hào)膚可引導(dǎo)所述融合元件的表 達(dá)或跨膜轉(zhuǎn)移（定位）。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白具有選自下組的結(jié)構(gòu)：
[0019] (1)式Ia所述結(jié)構(gòu)：
[0020] D-A-B(Ia)，或
[0021] 似式IIa所述結(jié)構(gòu)：
[0022] D-A-C-B(IIa), 陽(yáng)02引 其中，
[0024] A為比-12蛋白元件；
[0025] B為CD6化蛋白元件；
[0026] C為任選的連接膚元件；
[0027] D為任選的信號(hào)膚信號(hào)膚和/或前導(dǎo)膚序列；
[0028]表示連接上述元件的膚鍵或膚接頭。
[0029] 在另一優(yōu)選例中，所述的連接膚元件包括序列如SEQ ID NO. :7所示的連接膚。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的IL-12蛋白來(lái)源于人或非人哺乳動(dòng)物。
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述的IL-12蛋白包括野生型和突變型。
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述的IL-12蛋白包括全長(zhǎng)的、成熟形式的IL-12,或其活性片 段。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一蛋白元件包括IL-12蛋白的一個(gè)或兩個(gè)亞基。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述的IL-12蛋白的亞基選自下組：P40和P35亞基。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述的第一蛋白元件包括連接在一起的IL-12蛋白P40和P35 亞基。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述的P40和P35亞基為"頭-頭"、"頭-尾"、"尾-尾"相連。
[0037] 在另一優(yōu)選例中，所述的P40和P35亞基之間存在或不存在接頭（linker)。較佳 地，所述的接頭為柔性的4-20個(gè)氨基酸的接頭，更佳地，所述的接頭為GGGGGGS(Ge巧（SEQ IDNO. : 8) 陽(yáng)03引在另一優(yōu)選例中，所述的IL12蛋白元件的序列如SEQIDNO. :4所示。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD62L蛋白元件中具有K283-S284的切割位點(diǎn)。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD62L蛋白來(lái)源于人或非人哺乳動(dòng)物。
[0041] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD62L蛋白包括野生型和突變型。
[0042] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD62L蛋白包括全長(zhǎng)的、成熟形式的CD62L或其活性片 段。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述的CD62L蛋白元件的序列如SEQ ID NO.:6所示。 陽(yáng)044] 在另一優(yōu)選例中，所述的膚接頭的長(zhǎng)度為0-15個(gè)氨基酸，較佳地1-10個(gè)氨基酸。
[0045] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白還包括信號(hào)膚元件D。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白中，第一蛋白元件為單鏈IL-12,在所述單鏈 IL-12中，在P40亞基及P35亞基設(shè)有連接膚GeS(沈QIDNO. : 7)。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白中，在單鏈IL-12 (第一蛋白元件）和CD62L(第 二蛋白元件）之間設(shè)有連接膚，優(yōu)選218膚段（SEQIDNO. :8)。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.:2所示。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白具有W下多種特征：
[0050] a)所述融合蛋白被ADAM17蛋白切割，從而釋放IL-12 ;
[0051]b)所述融合蛋白包含IL-12的兩條亞基，即P40和P35亞基，并由GGGGGGS(G6巧 連接。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白為單體、或二聚體。
[0053]在本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核巧酸，所述的多核巧酸編碼第一方 面所述的融合蛋白。
[0054] 在另一優(yōu)選例中，所述的多核巧酸的序列如SEQ ID NO.:1所示。 陽(yáng)化5] 在本發(fā)明的第=方面，提供了一種載體，它含有本發(fā)明第二方面所述的多核巧酸。
[0056] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括質(zhì)粒、病毒載體。
[0057] 在另一優(yōu)選例中，所述的病毒載體包括：慢病毒載體、腺病毒載體、黃熱病毒載體。
[0058] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體包括表達(dá)載體。
[0059] 在本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，它含有本發(fā)明第=方面所述的載體 或基因組中整合有第二方面所述的多核巧酸。
[0060] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[0061] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞。
[0062] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括免疫細(xì)胞，較佳地T細(xì)胞、
[0063] 在本發(fā)明的第五方面，提供了一種產(chǎn)生第一方面所述的的蛋白的方法，它包括步 驟：
[0064](1)在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)本發(fā)明第四方面所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出第一 方面所述的的融合蛋白；和 陽(yáng)0化](2)任選地分離所述融合蛋白。
[0066] 在本發(fā)明的第六方面，提供了一種藥物組合物，所述組合物包含：
[0067] 第一方面所述的的融合蛋白，W及
[0068] 藥學(xué)上可接受的載體。
[0069] 在本發(fā)明的第屯方面，提供了一種免疫細(xì)胞，所述的免疫細(xì)胞攜帶（或在其細(xì)胞 表面存在）第一方面所述的的融合蛋白。
[0070] 在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞為至少IO3個(gè)（較佳地IO3-IO9個(gè)，更佳地較佳 地IO4-IQS個(gè)）所述免疫細(xì)胞的細(xì)胞群。
[0071] 在另一優(yōu)選例中，至少一部分或全部所述的融合蛋白位于所述免疫細(xì)胞的細(xì)胞膜 上，并且所述的第一蛋白元件即IL-12蛋白元件位于胞外。
[0072] 在另一優(yōu)選例中，所述的免疫細(xì)胞包括T細(xì)胞。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述的T細(xì)胞表面攜帶MRT-1TCR。
[0074] 在本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物包含：
[0075] 本發(fā)明第屯方面所述的免疫細(xì)胞，W及
[0076] 藥學(xué)上可接受的載體。
[0077] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物為液態(tài)。
[0078] 在另一優(yōu)選例中，所述的藥物組合物含有1XIO3-IXIO7個(gè)所述的免疫細(xì)胞/ml。
[0079] 在本發(fā)明的第九方面，提供了如第一方面所述的的融合蛋白和/或第屯方面所述 的免疫細(xì)胞的用途，用于制備治療腫瘤的藥物。
[0080] 在另一優(yōu)選例中，所述腫瘤包括：腦腫瘤、大腸癌腫瘤、肺癌腫瘤、肝癌腫瘤、乳腺 癌腫瘤、胃癌腫瘤、膜腺癌腫瘤。
[0081] 在本發(fā)明的第十方面，提供了一種治療腫瘤的方法，包括步驟：給需要的對(duì)象施用 第一方面所述的的融合蛋白和/或第屯方面所述的免疫細(xì)胞。
[0082] 在另一優(yōu)選例中，所述的融合蛋白W單體和/或二聚體形式施用。
[0083] 在另一優(yōu)選例中，所述的對(duì)象是人。
[0084] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)中，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具 體描述的各技術(shù)特征之間都可W互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在 此不再一一累述。
【附圖說(shuō)明】 陽(yáng)0化]圖1顯示了CD62L/l-selectin通過(guò)抗原特異性活化誘導(dǎo)的膜表面切割及釋放。
[0086] 其中，圖IA和圖IB顯示了膜分子CD6化切割及釋放的分子機(jī)制示意圖。如圖所 示，T細(xì)胞表面CD6化在接受抗原等特異性激活劑的作用下，細(xì)胞內(nèi)的微絲（actin等）發(fā) 生定向聚集，導(dǎo)致細(xì)胞膜表面的切割酶（Adaml7等）特異性剪切