，CD6化和 hsc]X-12通過(guò)連接膚進(jìn)行連接。 陽(yáng)202] T細(xì)胞通過(guò)兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)即MRT-ITCR(第一天）及圖示中S個(gè)載體的序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)（第 10天），于第14天，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞表面CD6化的表達(dá)及膜表面hsc比-12的表 達(dá)。 陽(yáng)203] 結(jié)果如圖5所示。利用第=代慢病毒載體表達(dá)CD62L/IL-12融合蛋白，所選 用的啟動(dòng)子為MSCV，已經(jīng)被廣泛地應(yīng)用于人體的腫瘤免疫細(xì)胞治療，具有表達(dá)的穩(wěn)定 性及安全性，表達(dá)基因構(gòu)件可W替代為需要表達(dá)的基因，即CD62L，MRT-I TCR W及 ]X-12/CD62L融合蛋白等。該載體的5'及3' LTRdong terminal repeat)被改造成 SIN-LTR(self-inactivating-LTR),目的是降低慢病毒重組的機(jī)率，增強(qiáng)安全性能，聯(lián)合 WPRE終止RNA轉(zhuǎn)錄的功能，是目前廣泛應(yīng)用于臨床的最新一代的基因工程載體結(jié)構(gòu)。人源 CD62Lhsc比-12化uman single chain比-12)及CD62L/hsc比-12的重組基因中，hsc比-12 融合了IL-12的分泌膚（lead seq)，通過(guò)基因克隆方法連接到慢病毒表達(dá)載體中，CD6化和 hsc比-12通過(guò)膚段SGSG鏈接。T細(xì)胞通過(guò)兩次轉(zhuǎn)導(dǎo)即MRT-ITCR(第一天）及圖示中S個(gè) 載體的序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)（第10天），于第14天，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞表面CD62L的表達(dá)及 膜表面hsc比-12的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示，CD6化可W大量表達(dá)于抗腫瘤T細(xì)胞表面，膜細(xì)胞 表面的IL-12只有在表達(dá)IL-12/CD62L的融合蛋白組中可W檢測(cè)出來(lái)，分泌型的IL-12膜 表面沒(méi)有表達(dá)，充分驗(yàn)證了圖4所示的機(jī)制。 陽(yáng)204] 如圖4所示，本發(fā)明的機(jī)制如下：比-12通過(guò)CD6化從膜表面的切割及釋放，且說(shuō) 明該種釋放是腫瘤免疫應(yīng)答所依賴(lài)的。根據(jù)該效應(yīng)機(jī)制，釋放的具有生物活性的IL-12能 夠增加抗腫瘤T細(xì)胞的抗腫瘤反應(yīng)，改善局部腫瘤免疫的微環(huán)境，實(shí)現(xiàn)優(yōu)化的抗腫瘤免疫 反應(yīng)。 陽(yáng)205] 實(shí)施例6 陽(yáng)206] IL-12/CD6化融合蛋白的增強(qiáng)免疫反應(yīng)效應(yīng)及腫瘤抗原依賴(lài)性的IL-12釋放
[0207] T細(xì)胞序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤TCR及CD62LASC比-12融合蛋白20天后，與腫瘤細(xì)胞526 及938共培養(yǎng)，24小時(shí)后，上清中IFN丫及IL-12表達(dá)水平通過(guò)化ISA試劑盒檢測(cè)。 陽(yáng)20引結(jié)果如圖6所示。慢病毒載體hsc比-12/CD6化轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞與腫瘤共培養(yǎng)可W增 強(qiáng)IFN丫的表達(dá)水平及腫瘤抗原依賴(lài)的釋放IL-12。T細(xì)胞序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤TCR及CD62L/ hsc比-12融合蛋白20天后，與腫瘤細(xì)胞526及938共培養(yǎng)，2地后，上清中IFN丫及IL-12 表達(dá)水平通過(guò)化ISA試劑盒檢測(cè)。正如預(yù)測(cè)的一樣，經(jīng)過(guò)IL-12可溶性基因修飾的抗腫瘤T 細(xì)胞，同膜表面的比-12/CD6化基因修飾的一樣，與抗腫瘤T細(xì)胞組相比較，都可W顯著增 加IFN丫的分泌水平，并且具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異。本發(fā)明進(jìn)一步證實(shí)，只有比-12/ CD6化組的IL-12的切割及釋放與腫瘤抗原的激活相關(guān)，可溶性的IL-12的持續(xù)分泌不受腫 瘤抗原的調(diào)控，維持在較高的水平。同時(shí)本發(fā)明也觀察到，膜表面切割及釋放的IL-12水平 比持續(xù)分泌的IL-12的水平低，我們預(yù)測(cè)該發(fā)明具有較高的安全性及臨床可操作性。 陽(yáng)209] 實(shí)施例7
[0210] IL-12/CD6化基因修飾的抗腫瘤T細(xì)胞的顯著體內(nèi)抑瘤效果 悅11] 實(shí)驗(yàn)方法：雌性pmel小鼠（每組7只小鼠）通過(guò)B16F10細(xì)胞植入煩內(nèi)（IC)S天， 細(xì)胞回輸前1天小鼠接受5Gy全身放療。鼠的T細(xì)胞取自小鼠的脾臟細(xì)胞，利用lOug/ml的刀豆蛋白（ConA)在IL-2巧lU/ml)存在的條件下活化；第2天，用圖示中慢病毒載體轉(zhuǎn) 導(dǎo)T細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)6天，收集細(xì)胞，通過(guò)小鼠尾靜脈注射（IV) 5XIO6個(gè)T細(xì)胞。DC組 小鼠的DC細(xì)胞取自骨髓細(xì)胞，經(jīng)過(guò)體外誘導(dǎo)分化成熟8天，通過(guò)腹腔接種IX1〇6細(xì)胞。DC 和T細(xì)胞的各組說(shuō)明見(jiàn)圖7右邊標(biāo)識(shí)。星號(hào)表示該實(shí)驗(yàn)組與其它組比較，p<0. 001。 陽(yáng)212] 結(jié)果如圖7所示。慢病毒載體hsc比-12/CD6化轉(zhuǎn)導(dǎo)鼠T細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞回輸治 療顯著延長(zhǎng)荷瘤小鼠的生存。 陽(yáng)213] 實(shí)施例8
[0214]IL-12/CD6化基因修飾的抗腫瘤T細(xì)胞的安全性
[0215] 實(shí)驗(yàn)方法：T細(xì)胞序貫轉(zhuǎn)導(dǎo)抗腫瘤TCR及CD62LASC比-12融合蛋白14天后，各組 細(xì)胞與對(duì)照轉(zhuǎn)導(dǎo)組（T-cell)的擴(kuò)增倍數(shù)比較，轉(zhuǎn)導(dǎo)持續(xù)分泌hsclkl2組較其它各組的擴(kuò) 增倍數(shù)顯著降低，p<0.001。其中，轉(zhuǎn)導(dǎo)hsc比-12/CD6化融合蛋白組同其它組比較擴(kuò)增倍數(shù) 相同，未見(jiàn)顯著差異。數(shù)據(jù)分析采用設(shè)定T-cell組的擴(kuò)增倍數(shù)為100%,其它各組的值系 與T-cell組的比值。
[0216] 結(jié)果如圖8所示。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，慢病毒載體hsc比-12/CD6化轉(zhuǎn)導(dǎo)的T細(xì)胞可W 有效避免持續(xù)性分泌IL-12造成的體外T細(xì)胞擴(kuò)增的毒副作用。 陽(yáng)217] 討論
[0218] 本發(fā)明的研究表明，通過(guò)基因修飾抗腫瘤T細(xì)胞表達(dá)新的IL-12/CD6化分子，利用 CD62L腫瘤抗原反應(yīng)性切割及釋放的特性，可W實(shí)現(xiàn)IL-12的抗原反應(yīng)性的腫瘤免疫反應(yīng) 的局部釋放，增強(qiáng)局部抗腫瘤的免疫反應(yīng)，并且顯著降低IL-12的毒副作用。
[0219] 同持續(xù)分泌IL-12基因修飾的抗腫瘤T細(xì)胞相比較，IL-12/CD6化融合蛋白基因 修飾的抗腫瘤T細(xì)胞不但可W顯著延長(zhǎng)荷瘤鼠的生存，還可W避免持續(xù)分泌IL-12誘導(dǎo)的 系統(tǒng)性細(xì)胞毒性，是一種全新的通過(guò)細(xì)胞膜表達(dá)IL-12,并通過(guò)CD6化來(lái)實(shí)現(xiàn)腫瘤抗原反應(yīng) 性的切割及釋放的全新的免疫細(xì)胞治療策略，在腫瘤的免疫細(xì)胞的治療中將發(fā)揮重要的作 用。
[0220] 在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請(qǐng)中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú) 引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可 W對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，運(yùn)些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限定的范 圍。 陽(yáng)221] 參考文獻(xiàn)
[0222] 1.Zhang,L.等人（2011)."ImprovingadoptiveTcelltherapybytargeting andcontrollingIL-12expressiontothetumorenvironment."MolTher19(4) :751-759. 陽(yáng)22引 2.Overwijk,W.W.等人（1998)."即 100/pmel17isamurinetumor rejectionantigen:inductionof"self"-reactive，tumoricidalTcellsusing high-affinity，alteredpeptideligand."JExpMed188(2):277-286.
[0224] 3.Yang,S.等人口008)?"Developmentofoptimalbicistroniclentiviral vectorsfacilitateshigh-levelTC民geneexpressionandrobusttumorcell recognition."GeneTher15 (21):1411-1423.
[0225] 4.Yang,S.，等人口Oil) ?"lliesheddingofCD62L(X-selectin)regulates化e acquisitionoflyticactivityinhumantumorreactiveTlymphocytes."PLoSOne 6(7) :e22560.
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種融合蛋白，其特征在于，所述融合蛋白包括融合在一起的以下元件： (i) 任選的位于N端的信號(hào)肽和/或前導(dǎo)肽； (ii) 第一蛋白元件； (iii) 第二蛋白元件；以及 (iv) 任選的位于第一蛋白元件和第二蛋白元件之間的連接肽元件； 其中，所述信號(hào)肽可操作地連于由（ii)、（iii)和（iv)所構(gòu)成的融合元件； 并且第一蛋白元件為IL-12蛋白元件；第二蛋白元件為⑶62L的蛋白元件。2. 如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述的融合蛋白具有選自下組的結(jié)構(gòu)： (1) 式Ia所述結(jié)構(gòu)： D-A-B(Ia)，或 (2) 式IIa所述結(jié)構(gòu)： D-A-C-B(IIa)， 其中， A為IL-12蛋白元件； B為⑶62L蛋白元件； C為任選的連接肽元件； D為任選的信號(hào)肽信號(hào)肽和/或前導(dǎo)肽序列； 表示連接上述元件的肽鍵或肽接頭。3. 如權(quán)利要求1所述融合蛋白，其特征在于，所述的第一蛋白元件包括連接在一起的 IL-12蛋白P40和P35亞基； 更佳地，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. :2所示。4. 一種分離的多核苷酸，其特征在于，所述的多核苷酸編碼權(quán)利要求1所述的融合蛋 白。5. -種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求4所述的多核苷酸； 更佳地，所述的病毒載體包括：慢病毒載體、腺病毒載體、黃熱病毒載體。6. -種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求5所述的載體或基因組中整合有權(quán)利 要求4所述的多核苷酸。7. -種產(chǎn)生權(quán)利要求1所述的蛋白的方法，其特征在于，它包括步驟： (1) 在適合表達(dá)的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，從而表達(dá)出權(quán)利要求1所 述的融合蛋白；和 (2) 任選地分離所述融合蛋白。8. -種藥物組合物，其特征在于，所述組合物包含： 權(quán)利要求1所述的融合蛋白，以及 藥學(xué)上可接受的載體。9. 一種免疫細(xì)胞，其特征在于，所述的免疫細(xì)胞攜帶權(quán)利要求1所述的融合蛋白。10. -種藥物組合物，其特征在于，所述的組合物包含 權(quán)利要求9所述的免疫細(xì)胞，以及 藥學(xué)上可接受的載體。
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明提供高效低毒的腫瘤治療劑及其制法和用途。具體地，本發(fā)明提供了一種IL-12/CD62L融合蛋白。在本發(fā)明中，通過(guò)利用含IL-12/CD62L融合基因的慢病毒修飾抗腫瘤T細(xì)胞，通過(guò)CD62L腫瘤抗原依賴(lài)性的激活所誘導(dǎo)的特異性切割及釋放，從而實(shí)現(xiàn)腫瘤抗原激活的細(xì)胞膜表面IL-12的釋放。實(shí)驗(yàn)表明，在本發(fā)明中，可在T細(xì)胞攻擊腫瘤的局部實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)和定時(shí)釋放IL-12，從而改變T細(xì)胞-腫瘤組織的免疫微環(huán)境，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗腫瘤免疫效果的最大化，并顯著降低毒副作用。
【IPC分類(lèi)】C07K19/00, C12N15/62, C12N15/861, A61K47/48, C12N15/867, C12P21/00, A61K38/20, C12N15/86, C12N5/10, A61P35/00
【公開(kāi)號(hào)】CN105218682
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510702467
【發(fā)明人】楊世成
【申請(qǐng)人】深圳精準(zhǔn)醫(yī)療科技有限公司
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年10月26日