免疫細胞培養(yǎng)試劑盒、免疫細胞培養(yǎng)方法和應用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥技術(shù)領(lǐng)域，特別設(shè)及一種用于免疫細胞培養(yǎng)的試劑盒，W及 一種免疫細胞培養(yǎng)方法和其應用。
【背景技術(shù)】
[0002] 眾所周知，惡性腫瘤是目前危害人類健康的第一殺手。WHNSCC(頭頸部腫瘤）為 例，據(jù)統(tǒng)計，全球每年約有650000新的HNSCC病人出現(xiàn)，有約350000癌癥患者死于HNSCC。 目前，手術(shù)切除瘤體、放療、化療依然是HNSCC的常用方法，但運些療法并未取得令人滿意 的效果。單純手術(shù)切除存在預后不佳、復發(fā)率和腫瘤轉(zhuǎn)移率較高等缺陷，而且不適合于晚期 癌癥患者。而在根治性切除前或后進行化療也并未達到改善HNSCC患者預后的效果?；?常常伴隨著多種副作用，例如腸道功能障礙、骨髓抑制、感染性疾病等，運大大影響了病人 生活質(zhì)量，且至少50%的局部晚期HNSCC患者在治療后的2年出現(xiàn)局部或遠處轉(zhuǎn)移復發(fā)。
[0003] HNSCC患者其外周血中具有很低濃度的CD3+、CD4+、和CD8巧細胞，而且運種情況 在進行治愈性手術(shù)后仍可能持續(xù)數(shù)年時間。據(jù)報道，腫瘤復發(fā)病人的血液中CD4巧細胞數(shù) 最低。將HNSCC細胞用IFN-丫或外源性祀向腫瘤抗原解化，可修復CTL對HNSCC細胞的識 另Ij?？梢?，通過免疫療法來增強腫瘤細胞對免疫識別的敏感性，從而達到改善臨床病程是很 有可能的。
[0004] 通常將機體內(nèi)輔助T細胞分為Thl和Th2細胞群，Thl細胞群分泌白細胞介 素（interle址in，IL)-2、干擾素（interferon,IFN)-丫、IFN-a、腫瘤壞死因子（tumor necrosisfactor,TNF)-e等，可W增強腫瘤殺傷細胞作用，激發(fā)遲發(fā)型超敏反應，是抗腫 瘤細胞免疫的主要細胞群?；?細胞群分泌IL-4、比-5、IL-6和IL-IO等，主要功能為刺激 B細胞增殖并產(chǎn)生抗體，介導體液免疫，是細胞免疫的抑制者，機體THUTH2平衡失調(diào)，設(shè)及 腫瘤免疫逃逸。 陽005] CTL(巧totoxic T lymphoc5rte)細胞即細胞毒性T淋己細胞，是一類CD3+CD8巧細 胞，能直接攻擊帶抗原的祀細胞，在T細胞抗腫瘤免疫、抗病毒感染和移植排斥反應中起重 要作用。在腫瘤細胞免疫過程中，樹突細胞DC值emlritic Cell)捕獲加工腫瘤細胞抗原和 其分泌的MHC-I類和MHC-II類分子結(jié)合，形成膚-MHC分子復合物，并提呈給T細胞，活化 CD4巧細胞和CD8巧細胞，啟動MHC-I類限制性CTL淋己細胞反應。
[0006] M肥-I類分子表達減少和缺失是腫瘤逃逸CD4+和CD8巧細胞殺傷的主要原因之 一，然而自然殺傷細胞（naturekillercell,NK)的殺傷活性無M肥限制，通過NK細胞毒 因子、穿孔素和TNF殺傷腫瘤細胞。
[0007] 另外，機體內(nèi)還存在一群既有NK細胞受體，又有T細胞受體TCR的NKT(na化ral killer T)細胞，對TCR刺激可產(chǎn)生大量IL-4及IFN-丫，同時具有ThO型細胞因子產(chǎn)生能 力，具有極強的化1誘導能力和Th2抑制能力。NKT細胞活化后具有NK細胞樣細胞毒活性， 因此NKT細胞的殺傷活性同樣無MHC限制，通過穿孔素、Fas配體和IFN-丫殺傷腫瘤細胞， 從而與CTL和NK相互協(xié)調(diào)，優(yōu)勢互補，發(fā)揮較大的抗腫瘤細胞免疫功能。
[0008] 細胞因子誘導的殺傷細胞CIK(巧tokine-induced killer cells)和NK細胞培養(yǎng) 是自體外周血單核細胞在體外用多種細胞因子共同培養(yǎng)后獲得的一群W CTL細胞或NK細 胞為主的異質(zhì)細胞。將CIK或NK細胞回輸至患者后，其具有對腫瘤細胞的殺傷活性，且有 利于機體免疫能力的提高。當前，由于免疫細胞治療在防止腫瘤復發(fā)和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移等方 面具有積極作用，其被認為是抗腫瘤細胞免疫治療的首選方案之一。
[0009] 抗腫瘤免疫淋己細胞的數(shù)量是影響腫瘤防治效果的關(guān)鍵因素之一，體外研究顯 示隨著抗腫瘤淋己細胞與腫瘤比例的上升，淋己細胞對腫瘤的殺傷效果線性增加。每次 靜脈輸入100億W上的抗腫瘤淋己細胞時，可顯著改善患者自體抗腫瘤細胞免疫功能。 Retro化Ctin是一種用于提高轉(zhuǎn)染效率的重組人纖維連接蛋白片段（CH-296)，1990年 Laurie等人發(fā)現(xiàn)運種蛋白片段還能刺激人T細胞DNA合成，可W與抗CD3抗體0KT3 -起用 于刺激T淋己細胞大量增殖，選擇與其它細胞因子配伍的方法，達到既能增加細胞增殖數(shù) 量，又能獲得抗腫瘤效應細胞理想的比例，對于增進免疫細胞抗腫瘤治療效果尤為重要。
[0010] 2009年Olioso等人報道應用細胞因子rhIFN-丫、rh比-2和OKT抗體培養(yǎng)CIK細 胞，該細胞群中CD3+CD8CTL約占68%，CD3+CD56+NKT約占30%，CD3-CD56+NK細胞群少于 3%。細胞因子比-15、比-2和比-12等被用于培養(yǎng)NK細胞，NK細胞比例94%左右。但是， 目前的CIK和NK細胞培養(yǎng)等方法，過度強調(diào)單一細胞成分，而忽略了其它細胞成分在抗腫 瘤細胞免疫的協(xié)同和互補優(yōu)勢。例如現(xiàn)有培養(yǎng)方法獲得的CIK細胞中，NK細胞和NKT細胞 比例偏少，而NK細胞培養(yǎng)方法又缺乏腫瘤細胞免疫中的生力軍CTL細胞群。盡管運些單一 種類的抗腫瘤免疫淋己細胞培養(yǎng)用于實驗研究可獲得該種類細胞群抗腫瘤的機制，但是應 用于腫瘤患者的臨床治療常常因為缺乏其它抗腫瘤細胞群的協(xié)同作用而效果有限。進一步 大部分單一種類的免疫細胞體外培養(yǎng)獲得的抗腫瘤效應淋己細胞數(shù)量不足，癌癥防治效果 等方面還值得進一步改善。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0011] 本發(fā)明提供一種抗腫瘤免疫細胞培養(yǎng)試劑盒，同時還提供采用該試劑盒培養(yǎng)免疫 細胞的方法。采用本發(fā)明方法培養(yǎng)得到的免疫細胞，細胞數(shù)量可達100億個細胞數(shù)左右，除 了CTL細胞群外，還含有較多的NK細胞和NKT細胞群。本發(fā)明的培養(yǎng)方法制得的免疫細胞 應用于HNSCC治療中，可W改善因化療而造成的免疫抑制，延長病人生存期。
[0012] 本發(fā)明為達到其目的，采用的技術(shù)方案如下：
[0013] 一種用于免疫細胞培養(yǎng)的試劑盒，包括培養(yǎng)液A，所述培養(yǎng)液A為向無血清淋己細 胞培養(yǎng)液中加入rhIFN- 丫、rh比-2、rhIL-15和人轉(zhuǎn)鐵蛋白制得。
[0014] 所述rhIFN- 丫、rh比-2、rh比-15和人轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述培養(yǎng)液中的終濃度依次分 別為 500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/mL、5-30ug/ml。
[0015] 所述試劑盒還包括包被液，所述包被液為向PBS緩沖液或無血清淋己細胞培養(yǎng)液 中加入0KT3抗體和Retronectin制得。
[0016] 優(yōu)選的，所述0KT3抗體和Retronectin在包被液中的終濃度均為50-200ng/mL。
[0017] 具體的，無血清淋己細胞培養(yǎng)液采用市面商業(yè)化的培養(yǎng)基即可，例如，無血清淋己 細胞培養(yǎng)液可采用KBM561培養(yǎng)基、RPMI1640培養(yǎng)基、切toRola301培養(yǎng)基等。
[0018] 本發(fā)明第二方面提供一種免疫細胞培養(yǎng)方法，包括如下步驟：
[0019] I)從離體的腫瘤病人的外周血、淋己結(jié)、腹水、胸水或腫瘤組織中分離出單核細 胞；
[0020] 2)將步驟1)中的單核細胞接種于激活培養(yǎng)基中，于包被液包被過的培養(yǎng)容器 中培養(yǎng)3~5天，用于激活誘導培養(yǎng)CD3+和/或CD56+細胞；所述激活培養(yǎng)基為向培養(yǎng) 液A中添加所述腫瘤病人的血漿制得，所述培養(yǎng)液A為向無血清淋己細胞培養(yǎng)液中加入 rhIFN-丫、rha-2、rh比-15和人轉(zhuǎn)鐵蛋白制得；所述包被液為向PBS緩沖液或淋己細胞基 礎(chǔ)培養(yǎng)基中加入0KT3抗體和Retronectin制得；
[0021] 3)將經(jīng)步驟2)培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移至另一培養(yǎng)容器中用培養(yǎng)液A繼續(xù)培養(yǎng)，每隔2~ 3天更換1次所述培養(yǎng)液A。細胞的總培養(yǎng)時間為9~25天，之后收集培養(yǎng)獲得的細胞群， 將其稱之為iCIK細胞（improvingc}ftokine-inducedkillercells,改良的CIK細胞）， 可用于病人自體回輸?shù)目鼓[瘤治療。
[0022] 優(yōu)選的，rhIFN-丫、rh比-2、rh比-15和人轉(zhuǎn)鐵蛋白在所述培養(yǎng)液A中的濃度依 次分別為 500-1000U/mL、500-5000U/mL、5-50ng/ml、5-30ug/ml。優(yōu)選的，所述 0KT3 和 Retronectin在包被液中的終濃度均為50-200ng/mL。優(yōu)選的，所述血漿在激活培養(yǎng)基中的 質(zhì)量百分比為0.5~10%。
[0023] 具體的，所述無血清淋己細胞培養(yǎng)液為RPMI1640培養(yǎng)基、切toRola301培養(yǎng)基或 KBM561培養(yǎng)基。
[0024] 優(yōu)選的，包被液在使用前8~24小時配制。
[0025] 優(yōu)選的，步驟1)為從離體的尚未進行化療的腫瘤病人的外周血、淋己結(jié)、腹水、胸 水或腫瘤組織中分離出單核細胞。
[00%] 所述腫瘤病人可W是頭頸部腫瘤病人，但并不局限于此。
[0027] 培養(yǎng)液A中還可添加rhIL-12、rhIL-18和rhIL-21等。
[0028] 采用上文所述的免疫細胞培養(yǎng)方法獲得的免疫細胞可在