制備用于預防或治療抗 腫瘤的制劑中應用。具體的，所述腫瘤可W是頭頸部腫瘤等。
[0029] 本發(fā)明提供的技術方案具有如下有益效果：
[0030] 本發(fā)明提供的培養(yǎng)方法制得的iCIK細胞較傳統(tǒng)細胞培養(yǎng)方法相比，其可獲得較 高比例的NK細胞和NKT細胞，細胞數(shù)量可達到100億個左右。 陽03U 將本發(fā)明培養(yǎng)制得的iCIK細胞應用于HNSCC患者的治療，發(fā)現(xiàn)和僅采用化療的 治療組相比，將化療和iCIK細胞注射結(jié)合的治療組，其無進展生存時間（PF巧和總生存期 (0巧均明顯高于僅采用化療的治療組。將本發(fā)明培養(yǎng)制得的iCIK細胞應用于HNSCC患者 的治療，通過和化療結(jié)合，具有很好的協(xié)同效應，可有效改善因化療造成的全身免疫抑制， 誘發(fā)腫瘤退化?？梢?，采用本發(fā)明培養(yǎng)方法制備的免疫細胞（iCIK細胞）在腫瘤治療方面 具有很好的療效，為腫瘤治療可提供了一種新的輔助治療手段，有助于延長HNSCC患者存 活期，改善全身免疫抑制。
【附圖說明】
[0032] 圖IA為治療方案示意圖；圖IB為分組方法示意圖；
[003引圖2中，圖A、B均為ACT治療組的患者化療前的腫瘤組織切片的肥染色圖；圖C為ACT治療組的患者動脈造影圖；圖D、E分別為ACT治療組的患者在化療后、iCIK細胞注 射治療后的腫瘤組織切片肥染色圖；圖F為ACT治療組的患者在iCIK細胞注射治療后的 圖片；
[0034] 圖3A、圖3B分別為無進展生存期（PF巧和總生存期（0巧的Kaplan-Meier生存曲 線；
[0035] 圖4中A、B圖分別為實驗組患者在化療前、化療后、注射iCIK細胞后的外周血中 分別分離的單核細胞按照實施例2的方法培養(yǎng)得到的免疫細胞的細胞毒性、細胞增殖能力 檢測結(jié)果；
[0036] 圖4中C、D圖為實驗組患者在化療前、化療后、注射iCIK細胞后的外周血中分別 分離的單核細胞按照實施例2的方法培養(yǎng)得到的免疫細胞的表型分析結(jié)果；圖4中E、F圖 為采用流式細胞術對實驗組患者在化療前、化療后、注射iCIK細胞后的外周血進行表型分 析的結(jié)果；
[0037]圖 4 各圖中的pre-chemotherapy、post-chemotherapy、ACT的結(jié)果分別對應于化 療前、化療后、注射iCIK細胞后。 陽03引 圖5,iCIK和CIK細胞增殖數(shù)量比較。
[0039] 圖6,患者周某iCIK和CIK細胞亞型流式細胞檢測結(jié)果。
【具體實施方式】
[0040] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的技術方案做進一步說明： 陽OW 實施例1
[0042] 一種用于免疫細胞培養(yǎng)的試劑盒，該試劑盒包括培養(yǎng)液A和包被液。
[0043] 其中，培養(yǎng)液A按照如下方法配制：將rhIFN-丫、rh比-2、rhIL-15和人轉(zhuǎn)鐵蛋白加 入無血清淋己細胞培養(yǎng)液中混勻而成，其中，所用的無血清淋己細胞培養(yǎng)液具體為邸M561 培養(yǎng)基（TaKaRa公司，日本）；rhIFN-丫（商品名為克隆伽瑪）、rhlk2(北京雙鸞藥業(yè)股份 有限公司）、rhlkl5和人轉(zhuǎn)鐵蛋白（Sigma公司，美國）在培養(yǎng)液A中的終濃度依次分別 為lOOOU/mL、1000U/mL、5ng/mL、5ug/ml。 W44] 包被液按照如下方法配制：將0KT3抗體和Retronectin加入PBS緩沖液中混勻而 成。其中，0KT3抗體（楊森制藥公司，日本）和RetronectinCTaKaRa公司，日本）在包被 液中的終濃度均為l(K)ng/mL。 W45] 實施例2
[0046] 一種免疫細胞培養(yǎng)方法，按照如下步驟進行：
[0047] 1)采用Ficoll-Hypaque密度梯度離屯、法，從尚未進行化療的頭頸部腫瘤病人的 外周血中分離出單核細胞（PBMC);
[0048] 2)將步驟1)的單核細胞接種于經(jīng)實施例1的包被液包被處理的培養(yǎng)瓶中，用激活 培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，于37 °C、5 %C〇2的細胞培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4天；其中，所用的激活培養(yǎng)基為向 實施例1的培養(yǎng)液A中添加該頭頸部腫瘤病人的血漿（自體血漿）制得，該血漿在該激活 培養(yǎng)基中的質(zhì)量百分比為2%;
[0049] 3)將經(jīng)步驟2)培養(yǎng)的細胞轉(zhuǎn)移至大培養(yǎng)瓶或培養(yǎng)袋，用實施例1中的培養(yǎng)液A繼 續(xù)培養(yǎng)，在培養(yǎng)過程中，每隔2~3天更換一次該培養(yǎng)液A。
[0050] 4)細胞的總培養(yǎng)時間為15天，培養(yǎng)結(jié)束后細胞數(shù)量達到100億個W上，收集細胞 群。
[0051] 經(jīng)檢驗無微生物污染后制成免疫細胞治療制品，可用于病人自體回輸?shù)目鼓[瘤治 療。
[0052] 該培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的免疫細胞將其稱為iCIK細胞（improving c^okine-in化cedkillercells,改良的CIK細胞）。步驟1)中的單核細胞也可W通過從 離體的腫瘤病人淋己結(jié)、腹水、胸水或腫瘤組織中分離獲得。 陽〇5引應用例1
[0054] 下面對按照本發(fā)明的培養(yǎng)方法培養(yǎng)獲得的iCIK免疫細胞（改良的CIK細胞）應 用于HNSCC病人的治療進行介紹如下： 陽化5] 3. 1實驗設計
[0056] 3. 11病人入洗_ :(1)年齡在18~75周歲；似處于治療初期階段；做ECOG評分 《2,預期壽命> 12周；(4)未進行放射治療；（5)中性粒細胞數(shù)> 2*109/1，血小板數(shù)> 100*1〇7l;(6)具備功能性的肝、腎、屯、血管系統(tǒng)；若病人存在中樞神經(jīng)系統(tǒng)轉(zhuǎn)移、或未被控 制的感染、或?qū)ιa(chǎn)生嚴重威脅的潛在疾病、或處于孕期或哺乳期，則不在入選范圍。
[0057] 3. 12分組（分組方法化圖1B):
[0058] 對照組（化療組）---共入選22位HNSCC患者，對對照組患者僅進行化療，在第一 天靜脈滴注120mg紫杉醇（Paclitaxel)、120mg順銷（Cisplatin)，在第1~5天持續(xù)靜脈 滴注1200mg氣尿喀晚巧-即）或16mgPYM。
[0059] 實驗組（ACT治療組）---共入選21位HNSCC患者，實驗組為化療結(jié)合iCIK細胞 注射治療，其治療方案見圖1A，即，在病人進行化療前從其外周血中分離出單核細胞，然后 按照和對照組相同的治療方式進行化療，在此期間對分離出的單核細胞進行體外培養(yǎng)，具 體按照實施例2的方法進行培養(yǎng)并獲得免疫細胞iCIK細胞；在化療完成后，向病人靜脈輸 注1~1. 9X1〇1°個iCIK細胞，每隔1個星期輸注1次，共輸注兩次。對于患有上頌竇鱗癌 的病人采用動脈注射（可參見圖2中C圖所示）。最后，進行根治性切除。
[0060] 入組患者情況可參見表1所示。
[0061] 表1病人一般臨床資料
[0062]
W64] 3. 2 結(jié)果 陽O化]3. 2. 1治療效果
[0066] 對ACT治療組診斷患有上頌竇鱗癌的患者在化療前、化療后、及注射iCIK細胞后 的腫瘤組織切片進行染色比較。其中圖2中A、B圖為患者化療前的活體組織切片的肥染 色圖，從圖2中A、B圖可見，其中有大量的非典型細胞，形成多重癌巢，且只有很少量的淋己 細胞浸潤。對化療后、及iCIK細胞注射治療后的腫瘤活體組織切片進行HE染色，其結(jié)果分 別可見圖2中D、E圖，從圖中可見，患者經(jīng)iCIK細胞注射治療后，有更多的淋己細胞滲透到 腫瘤中，腫瘤細胞被其周圍的T細胞所殺死，患者其腫瘤大小得到明顯減少（可見圖2中F 圖）?？梢姡珹CT治療組的患者經(jīng)治療后其腫瘤得W縮小，該患者其后續(xù)的根治性切除手術 非常成功?？梢姡诨熀筮M行iCIK細胞注射治療，可有效提高功能保全手術的可行性。
[0067] 對患者進行治療后隨訪（平均隨訪時長為4年），發(fā)現(xiàn)實驗組相比于對照組，實 驗組患者具有更佳的總生存期、和復原效果。實驗組的中位OS值和PFS值分別為58個 月、56個月，而對照組分別為45個月、40個月。對于OS值和PFS值達到3年的概率，實 驗組分別為81%、76%，對照組分別為56%、50%。結(jié)果可參見圖3A、圖3B，及表2。采用 RECIST(responseevaluationcriteriainsolidtumors)評價實驗組和對照組的客觀反 應率0RR，結(jié)果見表2。從表2可見，實驗組的治療療效不是暫時的，而是可持續(xù)維持的。
[0068] 表2治療有效性評價
[0071] 3. 2. 2不良巧麻
[0072] 與治療相關的不良反應見表3所示，可見，實驗組其不良反應均屬低級別，且和現(xiàn) 有的化療中采用紫杉醇、PYM、氣尿喀晚治療時的副作用一致，且和對照組相比，實驗組發(fā)生 骨髓細胞減少的病例更少，且未發(fā)現(xiàn)主要器官的功能異常。
[0073] 表3治療副作用及并發(fā)癥評價
陽0巧]3. 2. 3細胸毒忡評價及細胸蠟裙能力
[0076] 對實驗組患者在化療前、化療后、注射iCIK細胞后的外周血中分別分離的單核細 胞按照實施例2步驟2)~4)培養(yǎng)得到的免疫細胞進行細胞毒性、細胞增殖能力評價，結(jié)果 分別見圖4中A圖、B圖。
[0077] 所采用的細胞株：人舌癌細胞SCC-25,來自格里菲斯大學ESKITIS研究所；人 白血病細胞株K562,來自中山大學腫瘤中屯、；SCC-25和K562分別用DMEM(Sigma,USA)、 RPMI1640 (Gib