-氮鳥嚷嶺（8-AG)和異硫氯酸巧光素（門TC)標記山羊抗小鼠IgG 均購自Sigma公司；辣根過氧化物酶（HR巧標記的山羊抗小鼠IgG為金橋生物技術有限 公司進口分裝產(chǎn)品；SBAClonotyping?System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒購于Southern Biotechnology公司；快速連接試劑盒、pMAL?ProteinF^isionandPurificationSystem 融合蛋白表達與純化試劑盒購自化WENGLANDBiol油S(肥B)公司；CellfectinII Reagent購自Invitrogen公司；PremixExTaq服、T4DNA連接酶、DNAMarker、限制性內(nèi) 切酶BamHI和化ndIII購置于TaKaRa公司；抗6X化S標簽的單克隆抗體購自Roche公司； 化2^NTA樹脂購自Novagen公司。
[0031] 3、實驗動物
[0032] 8周齡BALB/c小鼠由中國農(nóng)業(yè)科學院哈爾濱獸醫(yī)研究所實驗動物中屯、提供。
[0033] 實施例1 BTV12-NS1蛋白的原核與真核表達及純化 W34] 1.引物設計
[0035] 原核表達采用祀T-30a原核表達系統(tǒng)，根據(jù)NCBI的BTV12-NS1基因序列（GenBank 登錄號：X63135. 1)設計PCR擴增引物：PET-BTV12-NS1-1-22F:
[0038] 真核表達采用Bac-to-Bac昆蟲桿狀病毒表達系統(tǒng)，按照上述序列分別設計PCR擴 增引物：
陽0創(chuàng) 2.BTV12-NS1蛋白的原核表達載體構建及NSl蛋白的原核表達與純化
[0043] 首先PCR擴增BTV12NS1基因，將獲得的目的片段進行膠回收，分別將回收產(chǎn)物和 原核表達載體祀T-30a進行BamHI、化ndIII雙酶切。純化后的酶切NSl基因和原核表達載 體祀T-30a進行連接，在DNA連接儀中25°C作用5min后將上述連接產(chǎn)物轉化E.COliD冊曰 感受態(tài)細胞中，37°C恒溫倒置過夜培養(yǎng)。隨機挑取單個菌落，接種于5mLLB液體抗性培養(yǎng) 基化an+100yg/mL)中，37°C過夜培養(yǎng)。提取重組質(zhì)粒進行初步篩選，空載體祀T-30a作為 陰性對照。對疑似重組質(zhì)粒分別進行雙酶切與PCR鑒定。將上述鑒定全部正確的含有陽性 重組質(zhì)粒的菌液進行測序，測序正確的重組質(zhì)粒命名為祀T-BTV12-NS1。
[0044] 將鑒定正確的重組質(zhì)粒祀T-BTV12-NS1轉化至E.COli化21感受態(tài)細胞中， 37°C過夜培養(yǎng)后，隨機挑取單個菌落，接種于5血LB液體培養(yǎng)基（IOOiig/mLKarO中 37°C過夜培養(yǎng)后進行重組NSl蛋白的誘導表達。首先取ImL過夜培養(yǎng)的新鮮菌液加入到 100血a00iig/mLKarOLB培養(yǎng)基中37°C培養(yǎng)至孤e。。。m約為0.5時加入終濃度為1.0mmol/L 的IPTG，37°C誘導化。菌體4度離屯、后進行超聲裂解，分別收集上清和沉淀進行SDS-PAGE 電泳，發(fā)現(xiàn)重組蛋白出現(xiàn)在沉淀中，W包涵體形式存在。原核表達載體祀T-30a攜帶6X化S 標簽，使用M2+NTA樹脂對其進行變性純化，結果只有一條特異性的條帶出現(xiàn)在70kDa左右 (圖1)，與NSl蛋白的分子質(zhì)量相符，蛋白濃度可達2mg/mL。利用HRP標記的抗6X化S標 簽單克隆抗體進行Western blot鑒定，表明NSl蛋白純化成功。
[0045] 3.BTV12-NS1蛋白的真核核表達載體構建及NSl蛋白的真核表達與純化
[0046] 首先PCR擴增BTV12NS1基因，將目的產(chǎn)物進行膠回收，回收獲得的片段與桿狀病 毒的穿梭載體PFas巧ac?HTA分別進行雙酶切。將純化后的酶切產(chǎn)物利用快速連接試劑盒 25°C連接5min后連接產(chǎn)物轉化至E.COliD冊a，37°C恒溫倒置過夜培養(yǎng)。隨機挑取單個 菌落，分別接種到5血LB液體抗性培養(yǎng)基（Amp+100yg/mL)中，37°C過夜培養(yǎng)。提取重組 質(zhì)粒進行初步篩選，空載體pFas巧ac?HTA作為陰性對照。對疑似重組質(zhì)粒分別進行雙酶切 與PCR鑒定。將上述鑒定全部正確的含有陽性重組質(zhì)粒的菌液進行測序，測序正確的重組 質(zhì)粒命名為pFast-BTV12-NSl。
[0047] 將鑒定正確的重組質(zhì)粒pFast-BTV12-NSl按照說明書轉化感受態(tài)細胞E.COli 畑lOBac?。首先將-80°C保存的感受態(tài)細胞DH10Bac?(100yL)置于冰上，融化后立即加 入1yL重組質(zhì)粒P化st-BTV12-NSl，混勻后冰浴30min，42°C熱激60s，冰浴5min，在超凈工 作臺內(nèi)向混合物中加入室溫的無抗生素的SOC液體培養(yǎng)基900yL37°C震蕩培養(yǎng)地。將 上述菌液分別做10倍、100倍、1000倍稀釋后各取100yLLA-Bac平板（LA-Bac平板即含 Kan+50Jig/mL、慶大霉素 7Jig/mL、四環(huán)素 10Jig/mL、X-gal100Jig/mL和IPTG40Jig/mL的LB固體培養(yǎng)基）上，37°C恒溫倒置培養(yǎng)4她，然后進行藍白斑篩選。隨機挑選單個白色菌落 劃線培養(yǎng)接種到新的LA-Bac平板上做3次純化鑒定，方法同上。當LA-Bac平板上菌落均 為大小均勻的白色菌落時，隨機挑取一個菌落分別接種至5mL含50yg/mLKan\7yg/mL慶 大霉素、10yg/mL四環(huán)素的LB液體培養(yǎng)基中，同時挑取藍色菌落作為陰性對照，37°C過夜 培養(yǎng)后分別提取重組桿粒與空桿粒。PCR鑒定正確的重組桿粒，命名為BAC-BTV12-NS1，用 于轉染獲得重組桿狀病毒。
[0048] 利用桿狀病毒轉染試劑CellfectinIIReagent,將重組桿粒BAC-BTV12-NS1轉染 Sf21昆蟲細胞，獲得帶有NSl基因的重組桿狀病毒BACV-NS1，同時設立野生型桿粒轉染與 單獨的轉染試劑作為陰性對照。具體操作如下： W例首先鋪Sf21細胞六孔板，W每孔Sf21細胞（細胞活力在97%W上）4.5X105 個/mL密度鋪于2血完全培養(yǎng)基（0. 1%1000 X雙抗，10%胎牛血清（FB巧，89%基礎培養(yǎng) 基）中，于27°C恒溫培養(yǎng)箱中至少培養(yǎng)比，待細胞完全貼壁后準備轉染，將1yg重組桿粒 BAC-BTV12-NS1稀釋至100yL基礎培養(yǎng)液（Grace粉（1X1L) 1瓶、酵母提取物3. 3g、水解乳 蛋白3.3邑、碳酸氨鋼（胞肥〇3)0.35邑）中，同時取混勻的〔61"6(：1：；[]11?6曰邑6]11：轉染試劑6 111 稀釋至新100yL基礎培養(yǎng)液中，兩者混勻后室溫解育30min。對照組1將1yg野生型桿粒 加入到100yL基礎培養(yǎng)液中與B液混勻，室溫解育30min，對照組2只加入B液，室溫解育 30min。期間棄掉細胞培養(yǎng)板中的原來的完全培養(yǎng)液，再用基礎培養(yǎng)液清洗細胞，2mL/次，共 清洗2次。SOmin后將800yL基礎培養(yǎng)液加入到已解育好的A液和B液的混合物中，混勻 后加入到Sf21昆蟲細胞六孔板中，27°C恒溫解育化后棄掉轉染液，加入新的完全培養(yǎng)基， 3.OmL/孔，27°C下解育至細胞發(fā)生明顯病變（75%的細胞病變）時，收集培養(yǎng)液，10(K)rpm離 屯、IOmin后收集上清，即為重組桿狀病毒母液，命名為BACV-NS1/P1，4°C避光保存?zhèn)溆?。?一定量的BACV-NS1/P1感染Sf21昆蟲細胞，不斷摸索最佳感染條件（用于病毒接種的最適 Sf21昆蟲細胞生長密度、最適病毒接種量、最適的病毒感染時間、最適的病毒收獲時間W及 蛋白表達量最高的病毒代數(shù)等），從而確定重組桿狀病毒BACV-NSl滴度最高與重組NSl蛋 白表達量最大時的病毒代次。BACV-W定義為空桿粒轉染Sf21昆蟲細胞獲得的野生型桿狀 病毒。收集感染重組桿狀病毒BACV-NS1/P1-P4的Sf21昆蟲細胞，1000巧m離屯、IOmin后 將細胞沉淀用PBS洗一次，離屯、后按照1:10的體積比例PBS懸浮，超聲裂解懸浮細胞，分別 收集上清和沉淀，進行SDS-PAGE電泳分析。結果確定蛋白表達量最大的重組桿狀病毒的感 染代次為BACV-NS1/P3,重組蛋白W包涵體形式存在，在70kDa左右出現(xiàn)1條明顯的條帶， 與NSl蛋白的分子質(zhì)量大小相符（圖2)。野生型桿狀病毒BACV-W表達蛋白按上述方法處 理后作為陰性對照。大量接種BACV-NS1/P2,W獲得足夠的重組NSl蛋白用于純化。由于真 核表達蛋白攜帶6X化S標簽，使用Ni2^NTA樹脂進行變性純化，蛋白濃度可達2mg/血。利 用HRP標記的抗6X化S標簽單克隆抗體進行Westernblot鑒定，表明BTV12-NS1蛋白表 達純化成功。
[0050] 實施例2單克隆抗體的制備 陽05U 1.免疫小鼠
[0052] WBac-to-Bac真核表達系統(tǒng)表達純化的重組BTV12-NS1蛋白作為免疫原腹腔多 點免疫8周齡雌性BALB/c小鼠3只，100yg/只，共免疫3次，1只未免疫的BALB/c小鼠在 相同條件下飼養(yǎng)作為陰性對照。一免將弗氏完全佐劑與純化的真核重組NSl蛋白等體積 比例混合；二免和=免均將弗氏不完全佐與純化的真核重組NSl蛋白等體積比例混合。分 別在二免與=免一周后尾靜脈采血，將血清和純化的原核重組NSl蛋白分別倍比稀釋后進 行間接化ISA檢測血清抗體效價和最佳抗原包被濃度。在融合前3天，