對(duì)抗體水平較高的 BALB/c小鼠直接腹腔注射50yg不加佐的劑純化重組NSl蛋白。 陽(yáng)05引 2.細(xì)胞融合
[0054] 融合前一周復(fù)蘇SP2/0骨髓瘤細(xì)胞。融合前1天準(zhǔn)備飼養(yǎng)層細(xì)胞，按照常規(guī)方法 取BALB/c小鼠腹腔巨隧細(xì)胞鋪于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中。融合當(dāng)天飼養(yǎng)層細(xì)胞狀態(tài)良好沒(méi)有 污染且SP2/0骨髓瘤細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行細(xì)胞融合：摘除免疫的BALB/c小鼠眼球 并采血后脫頸致死，消毒滅菌后在生物安全柜中無(wú)菌取脾并分離脾細(xì)胞，按脾細(xì)胞與SP2/0 骨髓瘤細(xì)胞4 : 1的比例用50%PEG進(jìn)行細(xì)胞融合，融合后的細(xì)胞鋪于準(zhǔn)備好的飼養(yǎng)層細(xì) 胞之上。
[0055] 3.陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞株的篩選及克隆
[0056] 利用純化后的原核表達(dá)的BTV12NS1蛋白建立的間接化ISA檢測(cè)方法篩選陽(yáng)性雜 交瘤細(xì)胞株，對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，同時(shí)用有限稀釋法對(duì)陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行3 次克隆純化，將克隆好的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞及時(shí)凍存。最終獲得1株穩(wěn)定分泌抗BTV12NS1蛋 白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為BTV12-NS1-IF8,保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管 理中屯、，其微生物保藏號(hào)是：CGMCCNo. 10207。
[0057] 4.單克隆抗體腹水的制備
[0058] 在注射雜交瘤細(xì)胞前一周，先取雌性BALB/c小鼠（8-12周齡）腹腔注射石蠟 油SOOiiL/只，一周后腹腔注射DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液稀釋的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞（細(xì)胞密度為 1-2X1〇6個(gè)/mL)，500yL/只。此后觀察小鼠狀態(tài)，小鼠腹部逐漸變大，待其行動(dòng)不便時(shí)收 集腹水。收集的腹水離屯、上清分裝后-20°C保存，將獲得單抗命名為BTV12-NS1-1F8。
[0059] 實(shí)施例3單克隆抗體的鑒定
[0060] 1.單克隆抗體的亞類鑒定
[0061] 按照SBAClonotyping?System/HRP抗體亞類鑒定試劑盒操作說(shuō)明書(shū)對(duì)實(shí)施例 1所得到的單克隆抗體進(jìn)行亞類鑒定，具體流程如下：W原核表達(dá)的重組BTV12-NS1蛋白 作為包被抗原，W實(shí)施例2所得的單抗BTV12-NS1-1F8作為一抗，分別WHRP標(biāo)記的IgGU IgG2a、IgG化、IgG3、IgM、IgA、K鏈、A鏈、羊抗鼠抗體為二抗，進(jìn)行間接化ISA鑒定。 陽(yáng)06引結(jié)果顯示本發(fā)明單克隆抗體BTV12-NS1-1F8的重鏈為IgGi,輕鏈為A鏈。
[0063] 2. IFA試驗(yàn)（重組桿狀病毒感染BHK-21細(xì)胞的IFA鑒定）
[0064] (1)使用BHK-21細(xì)胞鋪板（96細(xì)胞培養(yǎng)板），細(xì)胞生長(zhǎng)至板底面積的80-90%時(shí)， 分別接種BTV1-24,不接毒的BHK-21細(xì)胞作為陰性對(duì)照。 陽(yáng)0化](2)接毒24-36小時(shí)細(xì)胞尚未發(fā)生明顯病變時(shí)，棄去培養(yǎng)液，加入預(yù)冷的90%乙醇 4度固定30min。
[0066] 做棄去固定液，PBST清洗3次，5min/次。
[0067] (4)將篩選出的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清加入上述細(xì)胞培養(yǎng)孔中，100yL/孔。 同時(shí)W200X稀釋的小鼠陰、陽(yáng)性血清作為陰陽(yáng)性對(duì)照。 W側(cè)妨37°C解育比后，棄去一抗，用PBST清洗3次，5min/次。 W例 （6)將FITC標(biāo)記山羊抗小鼠的二抗50X稀釋，50化/孔，加入到上述細(xì)胞培養(yǎng)孔 中。
[0070] (7) 37°C解育比后，棄二抗，PBST清洗3次，5min/次；然后巧光顯微鏡拍照記錄。
[0071] IFA結(jié)果顯示該單克隆抗體BTV12-NS1-1F8培養(yǎng)上清與感染BTV12的BHK-21細(xì) 胞呈陽(yáng)性反應(yīng)，而與感染BTV1-11，BTV13-24及未感染BTV的BHK-21細(xì)胞呈陰性反應(yīng)（圖 3)O
[0072] 3.Westernblot實(shí)驗(yàn)
[0073] BTV12型感染BHK-21細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變時(shí)8000巧m離屯、取沉淀進(jìn)行 SDS-PAGE電泳，未接毒的BHK-21細(xì)胞沉淀作為陰性對(duì)照，進(jìn)行Westernblot鑒定。半干轉(zhuǎn) 印儀將SDS-PAGE膠轉(zhuǎn)印至NC膜，5%脫脂乳4°C封閉過(guò)夜后，陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞分泌的單克隆 抗體作為一抗，冊(cè)R標(biāo)記的山羊抗鼠IgG作為二抗，DAB顯色，掃描實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖4)。 陽(yáng)074] 實(shí)施例4NS1蛋白B細(xì)胞表位的鑒定
[0075] 1.NSl蛋白55條短膚的截短表達(dá)
[0076] (1)將NSl蛋白截短表達(dá)為55條相互重疊6個(gè)aa的16膚，據(jù)此W祀T-BTV12-NS1 質(zhì)粒為模版設(shè)計(jì)55對(duì)互補(bǔ)的寡核酸鏈序列，在編碼區(qū)的5'引入BamHI，3'端引物化ndIII 酶切位點(diǎn)；
[0077] (2)寡核巧酸鏈合成回來(lái)后，取出一管，直接稀釋100倍成lOpmol，稀釋前將管離 屯、，稀釋后震蕩混勻。分別將55對(duì)互補(bǔ)的寡核巧酸鏈55°C退火15min，形成帶有粘性末端 的雙鏈DNA; 陽(yáng)07引 （3)使用限制性內(nèi)切酶BamHI和化ndIII對(duì)原核表達(dá)載體pMLTM-c4X進(jìn)行雙酶 切； 陽(yáng)079] (4)將雙酶切膠回收之后的pML?-c4X與退火后形成的雙鏈DNA連接，25°C作用 Smin;
[0080] 巧）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.COliDH5。雙酶切及PCR鑒定正確后進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序正 確的55個(gè)重組質(zhì)粒分別命名為pNSl-l~pNS-55。此后，將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pNSl-l~ pNS-55轉(zhuǎn)化E.COli化21感受態(tài)細(xì)胞，隨機(jī)挑取單個(gè)菌落接種到5mLLB液體培養(yǎng)基 (Amp+100yg/血）中，37°C過(guò)夜培養(yǎng)； 陽(yáng)0川 （6)取新鮮菌液W1:100接種于10血LB液體培養(yǎng)基（Amp+100yg/血）中，37°C培 養(yǎng)至菌液ODe。。?約為0. 5,加入誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度為Immol/l，37°C誘導(dǎo)表達(dá)地，離屯、收 集菌體。菌體按10:1例PBS懸浮，超聲裂解后分離上清和沉淀，SDS-PAGE電泳發(fā)現(xiàn)，蛋白 W上清形式存在，大小與預(yù)期相符（圖5)。
[0082] 2.B細(xì)胞表位的初步鑒定
[0083] 將上述確定成功表達(dá)的55條短膚，分別朗農(nóng)度10化g/孔包被化ISA反應(yīng)板，W實(shí) 施例2所得的單克隆抗體BTV12-NS1-1F8作為一抗利用間接化ISA進(jìn)行篩選確定此單克隆 抗體所對(duì)應(yīng)的抗原表位（圖6)。 陽(yáng)084] 將篩選的抗原表位利用WesternBlot進(jìn)行進(jìn)一步確定，將鑒定反應(yīng)的短膚、空載 體pML?-c4X表達(dá)蛋白W及真核表達(dá)重組NSl蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳后，轉(zhuǎn)印至NC膜上， 用上述已鑒定表位的雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清作為一抗，山羊抗小鼠HRP-IgG作為二抗，DAB顯 色（圖7)。 陽(yáng)O化]間接ELISA與WesternBlot結(jié)果均證實(shí)BTV12-NS1-1F8與pNSl-7反應(yīng)，對(duì)應(yīng)NSl蛋白氨基酸Sip服AFQLVELAKEAMY?(SEQIDNO. 1 所示）。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一株分泌抗藍(lán)舌病病毒（Bluetonguevirus,BTV) 12型NSl蛋白單克隆抗體的 雜交瘤細(xì)胞株，保藏在中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心，其微生物保藏號(hào)為：CGMCC No.10207。2. 由權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗藍(lán)舌病病毒12型NSl蛋白的單克隆抗 體。3. 藍(lán)舌病病毒12型NSl蛋白的線性B細(xì)胞表位，其特征在于，所述表位多肽由權(quán)利要 求2所述的單克隆抗體所識(shí)別，所述表位的氨基酸序列如SEQIDNO. 1所示。4. 權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株在制備鑒別、診斷、預(yù)防或治療藍(lán)舌病病毒12型感 染的試劑與藥物中的應(yīng)用。5. 權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在制備鑒別、診斷、預(yù)防或治療藍(lán)舌病病毒12型感染 的試劑與藥物中的應(yīng)用。6. 權(quán)利要求3所述的線性B細(xì)胞表位在制備鑒別、診斷、預(yù)防或治療藍(lán)舌病病毒12型 感染的試劑與藥物中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了抗藍(lán)舌病病毒(Bluetongue？Virus，BTV)12型NS1蛋白的單克隆抗體BTV12-NS1-IF8及其識(shí)別的B細(xì)胞表位和應(yīng)用。所述的單克隆抗體是由本發(fā)明篩選得到的微生物保藏號(hào)為CGMCC？No.10207的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生，實(shí)驗(yàn)證明該雜交瘤細(xì)胞株分泌的抗BTV12？NS1蛋白單克隆抗體能夠與BTV12型NS1蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)。此外，本發(fā)明還公開(kāi)了該單克隆抗體所識(shí)別的BTV12？NS1蛋白特異性B細(xì)胞表位。本發(fā)明的單克隆抗體以及該單克隆抗體所識(shí)別的BTV12？NS1蛋白特異性B細(xì)胞表位可用于制備鑒別、診斷、預(yù)防或治療BTV12型感染的試劑，同時(shí)為以表位為基礎(chǔ)的診斷方法建立和表位標(biāo)記疫苗的設(shè)計(jì)奠定基礎(chǔ)，為進(jìn)一步研究和治療BTV12型提供物質(zhì)儲(chǔ)備。CGMCC No.1020720141223
【IPC分類】A61K39/42, A61P31/14, C12R1/91, G01N33/577, C07K16/10, G01N33/569, C07K7/08, C12N5/20
【公開(kāi)號(hào)】CN105219733
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510662588
【發(fā)明人】吳東來(lái), 孫恩成, 徐青元, 楊濤
【申請(qǐng)人】中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所
【公開(kāi)日】2016年1月6日
【申請(qǐng)日】2015年10月14日