一種新孢子蟲病檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利說(shuō)明】-種新抱子蟲病檢測(cè)試劑盒 發(fā)明領(lǐng)域
[000。 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，是設(shè)及一種基于3D數(shù)字PCR標(biāo)量陽(yáng)性對(duì)照 建立的新抱子蟲病巧ea^TimePCR)檢測(cè)試劑盒，用于不同動(dòng)物感染新抱子蟲病的臨床診 斷和日常監(jiān)測(cè)。
【背景技術(shù)】
[0002] 新抱子蟲病（Neosporiasis)是1998年新發(fā)現(xiàn)的一種原蟲病。病原為犬新抱子蟲 (Neosporacaninum)，寄生于多種哺乳動(dòng)物有核細(xì)胞內(nèi)，可導(dǎo)致妊娠母畜發(fā)生流產(chǎn)、弱產(chǎn)、 死胎等，新生仔畜發(fā)生運(yùn)動(dòng)障礙和神經(jīng)系統(tǒng)疾病等，牛對(duì)該病尤為靈敏。犬是新抱子蟲的終 末宿主兼中間宿主，牛、馬、羊、鹿等家畜及多種野生動(dòng)物均可W作為其中間宿主，健康動(dòng)物 通過(guò)吞食被新抱子蟲抱子化卵囊或速殖子污染的水或飼草而發(fā)生水平感染，胎兒及仔畜主 要通過(guò)胎盤而發(fā)生垂直感染，垂直感染是該病的主要傳播方式。新抱子蟲感染后主要寄生 于宿主動(dòng)物的腦、脊髓、神經(jīng)和內(nèi)臟等組織中。據(jù)報(bào)道，該病在世界范圍內(nèi)牛類動(dòng)物中的感 染率為10 %~40 %，最高達(dá)82 % ;我國(guó)新疆、青海、北京、吉林等地也有該病的報(bào)道，其感染 率為11. 8%~25. 4%不等。每年由該病導(dǎo)致的繁殖障礙性疾病給畜牧業(yè)生產(chǎn)造成了巨大 的經(jīng)濟(jì)損失。目前，還沒有可用于防治該病的有效疫苗和特效藥物，準(zhǔn)確的檢測(cè)、監(jiān)控技術(shù) 結(jié)合患畜淘汰等措施是綜合防治該病的關(guān)鍵。
[0003] 傳統(tǒng)的免疫組織化學(xué)技術(shù)、超微結(jié)構(gòu)檢測(cè)技術(shù)、病原分離技術(shù)等方法過(guò)程冗長(zhǎng)、操 作繁瑣，不適用于該病的檢測(cè)。目前，用于檢測(cè)該病的方法主要有血清學(xué)方法檢測(cè)抗體和分 子生物學(xué)方法檢測(cè)病原DNA。血清學(xué)方法在蟲體感染早期的檢測(cè)效果欠佳，本研究運(yùn)用分 子生物學(xué)方法著力于研制新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)試劑盒，用于早期感染和隱性"帶 蟲"階段的蟲體DNA檢測(cè)，與新抱子蟲病巧LISA抗體檢測(cè)試劑盒形成優(yōu)勢(shì)互補(bǔ)，為新抱子蟲 感染全程的臨床診斷和日常監(jiān)測(cè)提供科學(xué)的技術(shù)支撐。
[0004] 近年研究發(fā)現(xiàn)，由化SRS2基因編碼的P43蛋白是最有希望成為新抱子蟲病的診斷 抗原和免疫疫苗之一。實(shí)時(shí)巧光定量PCR技術(shù)巧ea^TimePCR)具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、 穩(wěn)定性好、方便快捷等特點(diǎn)，已被廣泛運(yùn)用于各種病原的定性和定量檢測(cè)。其中，化qman MGB探針3'端能準(zhǔn)確結(jié)合到DNA雙鏈小溝部，相對(duì)于其他探針具有更好的特異性、靈敏性和 穩(wěn)定性。3D數(shù)字PCR技術(shù)（3DDigitalPCR)是美國(guó)ABI公司于2008年新研發(fā)的基于單 拷貝模板擴(kuò)增而設(shè)計(jì)的一項(xiàng)新型絕對(duì)定量分析技術(shù)，它是通過(guò)PCR擴(kuò)增和收集發(fā)生的巧光 信號(hào)讀取陽(yáng)性反應(yīng)數(shù)，再根據(jù)泊松分布計(jì)算出陽(yáng)性模板DNA分子數(shù)。結(jié)合3D數(shù)字PCR技術(shù) 建立實(shí)時(shí)巧光定量PCR(Real-TimePCR)檢測(cè)方法，無(wú)需依賴陽(yáng)性核酸標(biāo)準(zhǔn)品和Real-Time PCR擴(kuò)增曲線的循環(huán)闊值（Ct)即可實(shí)現(xiàn)對(duì)擴(kuò)增模板進(jìn)行絕對(duì)定量分析。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的：為與新抱子蟲病巧LISA抗體檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)效果形成優(yōu)勢(shì)互 補(bǔ)，本發(fā)明通過(guò)設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和巧光探針，結(jié)合3D數(shù)字PCR系統(tǒng)絕對(duì)定量分析，通過(guò)優(yōu)化反 應(yīng)體系和循環(huán)條件，建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)方法。并建立一種基于3D數(shù)字PCR 標(biāo)量的新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)試劑盒，用于新抱子蟲病的臨床診斷和流行病學(xué)監(jiān) 測(cè)。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案如下：為實(shí)現(xiàn)上述目的，發(fā)明人下載GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中已報(bào)道 的不同國(guó)家和地區(qū)的新抱子蟲化SRS2基因序列，通過(guò)DNAMAN軟件分析下載序列的同源性， 找出特異性的保守祀序列，其核巧酸序列如SEQ ID NO. 4所示，將該祀序列作為檢測(cè)新抱子 蟲病的遺傳標(biāo)記物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，該序列的特異性片段只可作為檢測(cè)新 抱子蟲病的遺傳標(biāo)記物。
[0007] 設(shè)計(jì)檢測(cè)引物、巧光探針和獲得地方陽(yáng)性目的基因片段 ①根據(jù)上述新抱子蟲化SRS2基因（登錄號(hào)：U93870. 1)保守序列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和MGB巧光探針。上游引物化SRS2F : 5 ' -TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3 '，下游引物化SRS2R: 5' -CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3';探針5'端標(biāo)記FAM巧光報(bào)告基團(tuán)，3'標(biāo)記MGB巧光澤滅 基團(tuán)，巧光探針化SRS2P為：5' -FAM-TTATTCCGCCGTGTTTC-MGB-3'。②運(yùn)用PCR技術(shù)從地方 陽(yáng)性樣品基因組DNA中擴(kuò)增目的基因片段。NCSRS2F/R常規(guī)PCR反應(yīng)體系為25yL : 10 X PCR Buffer(Mg2+plus)2. 5yL，dNTP(2. 5mM)2yL，hq DNA聚合酶巧U/yL)0. 15yL，上、下游 引物（lOpM)各IyL，模板DNAI.5yL，d地2〇補(bǔ)足25yL。擴(kuò)增條件為：94°C預(yù)變性5min; 94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；72°C延伸5min，擴(kuò)增14化p的目的 基因片段。
[0008] 目的基因的克隆、測(cè)序 ①回收、純化擴(kuò)增的目的基因片段連入祀ASY-BluntZeroClongVector,再轉(zhuǎn)入大腸 桿菌Transl-Tl感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)AmpYLB培養(yǎng)基擴(kuò)大培養(yǎng)后，運(yùn)用Plasmid化rification Kit提取菌體質(zhì)粒，并對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行PCR鑒定。②將PCR鑒定為陽(yáng)性的重組質(zhì)粒和克隆菌送 至北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與化SRS2基因（登錄號(hào)：U93870. 1) 序列進(jìn)行相似性比對(duì)。
[0009] 建立新抱子蟲病實(shí)時(shí)巧光定量PCR (Real-Time PCR)檢測(cè)方法 ①3D數(shù)字PCR系統(tǒng)對(duì)提取的某一陽(yáng)性質(zhì)粒（32. 5ng/iiL)稀釋的10 6、10 \ 10 8滴 度進(jìn)行絕對(duì)定量分析，W篩選引物、探針的最佳退火-延伸溫度和確定該質(zhì)粒中實(shí)際參 與Real-TimePCR反應(yīng)的模板濃度。3D數(shù)字PCR反應(yīng)體系為15yL:2X3DMasterMix 7. 5化，引物、探針（IOpM)各1化，模板DNA2iiL，d地2〇補(bǔ)足15化。循環(huán)條件為：96°C預(yù) 變性IOmin;58°C退火-延伸2min，98°C變性30s，40次循環(huán)；60°C延伸2min。②均勻設(shè)計(jì) 法優(yōu)化Real-TimePCR反應(yīng)中模板濃度、引物濃度、退火-延伸溫度和延伸時(shí)間及擴(kuò)增循環(huán) 數(shù)等參數(shù)。優(yōu)化的Real-TimePCR反應(yīng)體系為25yL:2XReal-TimePCRMix12. 5^以引 物、探針（I化M)各IyL巧光校正液0. 5yL模板DNA IyL(1地2〇補(bǔ)足25yL。循環(huán)條件 為：95°(：預(yù)變性5111111;95°(：變性153,58°(：退火-延伸453,45次循環(huán)。根據(jù)該反應(yīng)條件建立 新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)方法標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程。③運(yùn)用優(yōu)化的反應(yīng)條件分別擴(kuò)增 新抱子蟲、弓形蟲、牛環(huán)形泰勒蟲、牛己貝斯蟲和牛雙芽己貝斯蟲等蟲種陽(yáng)性DNA，W評(píng)價(jià)其 特異性。④對(duì)該質(zhì)粒的10°至10 9的每一稀釋滴度進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增，并比較常規(guī) PCR和Real-TimePCR的檢測(cè)靈敏性。⑥重復(fù)3次對(duì)該質(zhì)粒的IO3Copies/yLIO4Copies/ yL和IO5Copies/yL的稀釋滴度進(jìn)行Real-TimePCR擴(kuò)增，每個(gè)稀釋濃度均設(shè)計(jì)3個(gè)平行， 計(jì)算其組間、組內(nèi)變異系數(shù)，W評(píng)價(jià)Real-TimePCR檢測(cè)方法的穩(wěn)定性。
[0010] 新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)試劑盒的制備及使用 ①試劑盒用途：本試劑盒用于檢測(cè)家畜是否罹患新抱子蟲病，可準(zhǔn)確檢測(cè)出家畜體內(nèi) 新抱子蟲蟲體DNA，在初期感染和"帶蟲"階段的檢測(cè)效果特別準(zhǔn)確，為新抱子蟲病的臨床檢 測(cè)和流行病學(xué)監(jiān)測(cè)提供科學(xué)的技術(shù)支持。②試劑盒的原理：本檢測(cè)試劑盒采用實(shí)時(shí)巧光定 量PCR檢測(cè)技術(shù)巧ea^TimePCR)，根據(jù)GenBank中已發(fā)表的新抱子蟲化SRS2基因保守序 列設(shè)計(jì)檢測(cè)引物和MGB探針，建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)方法。結(jié)合3D數(shù)字PCR 檢測(cè)技術(shù)（3DDigitalPCR)篩選該檢測(cè)方法的最佳退火-延伸溫度和對(duì)最低有效檢測(cè)量 進(jìn)行絕對(duì)定量分析。通過(guò)探討Real-TimePCR檢測(cè)方法特異性、靈敏性、穩(wěn)定性和重復(fù)性等 特性，組裝新抱子蟲病Real-TimePCR檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)新抱子蟲病，該試劑盒適用于 Real-TimePCR系統(tǒng)擴(kuò)增。③自備材料：實(shí)時(shí)巧光定量PCR(Real-TimePCR)系統(tǒng)；微量振 蕩離屯、機(jī)；96孔反應(yīng)板或Real-TimePCR8聯(lián)管；移液器及吸頭等。
[0011] 樣本要求：樣本采集后應(yīng)及時(shí)提取DNA，樣本DNA可參照DNA提取試劑盒或CTAB 法提取。若不能及時(shí)提取樣品可暫時(shí)儲(chǔ)存于-20°C冰箱中，2周內(nèi)提?。惶崛〉腄NA儲(chǔ)存 于-20°C待檢