。
[0012] 新抱子蟲病Real-TimePCR檢測試劑盒操作及注意事項 ①提前準備彼此獨立的制樣、加樣的操作室和移液器。②在制樣室中配置反應體系， 從-2(TC冰箱取出試劑盒中的適量試劑放置于室溫自然融化，低速離屯、后根據(jù)預設的反應 體系進行配制。③反應體系配制好后置于微量振蕩離屯、機上充分振蕩混勻，在冰盒上分裝 至96孔反應板或8聯(lián)反應管中。④將分裝的反應體系轉(zhuǎn)至加樣室加樣。⑥加樣時遵循先 加待檢樣品，再加陰、陽性對照（陰性對照先于陽性對照）。其中，每加完一排樣品更換加樣 手套，蓋好管蓋，避免彼此污染，最后加入陰、陽性對照。⑧加樣完畢后置于微量震蕩離屯、機 中充分振蕩混勻，置于Real-TimePCR儀中進行擴增。
[0013] 有益效果：運用該檢測試劑盒監(jiān)測我區(qū)（新疆地區(qū)）牛（巧牛）、馬、羊、鹿等家畜 新抱子蟲病，結(jié)合淘汰患畜的措施從而達到凈化畜群的目的，為保障我區(qū)畜牧業(yè)的健康發(fā) 展奠定了良好的基礎。
【附圖說明】
[0014] 下面結(jié)合附圖對本發(fā)明作進一步的說明。
[0015] 圖1所示為新抱子蟲陽性DNA常規(guī)PCR擴增結(jié)果。其中M為化2000DNAMarker, P為新抱子蟲陽性DNA檢測，N為陰性對照。圖2所示為3D數(shù)字PCR系統(tǒng)對化SRS2F/R和 NCSRS2P最佳退火-延伸溫度的篩選，篩選出最佳退火-延伸溫度為58°C。圖3所示為3D 數(shù)字PCR系統(tǒng)對陽性質(zhì)粒（32. 5ng/yL)稀釋的10 6、10 \ 10S滴度的絕對定量分析結(jié)果。圖 4所示為建立的新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法標準曲線。圖5所示為化SRS2F/R引物 常規(guī)PCR擴增陽性DNA產(chǎn)物在146bp處的特異性條帶。圖6所示為新抱子蟲病Real-Time PCR檢測方法的特異性實驗結(jié)果。出現(xiàn)的擴增曲線為新抱子蟲陽性DNA檢測。圖7所示為 NCSRS2F/R引物常規(guī)PCR檢測的靈敏性實驗結(jié)果。其中，M為化2000DNAMarker, 1~8為 6. 41XIO9~6. 41X10 2Copies/yL的稀釋質(zhì)粒。圖8所示為新抱子蟲病Real-TimePCR檢 測方法的靈敏性實驗結(jié)果。其中，1~10為6. 41XIO9~6. 41X10 "copies/yL的稀釋質(zhì) 粒，N為陰性對照。
【具體實施方式】
[0016] 下列實施例旨在進一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應理解為對本發(fā)明的限制。在不 背離本發(fā)明精神和實質(zhì)的情況下，對本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改或替換，均屬于本 發(fā)明的范圍。
[0017]若未特別指明，實施例中所用的技術手段為本領域技術人員所熟知的常規(guī)手段。
[0018] 本發(fā)明中使用的主要試劑有：PremixEx化9?(ProbeqPCR)、TaKaRa化9?、DL 2000DNAMarker、PlasmidPurificationKit等均購自寶生物工程（大連）有限公司； 如antSl:udio?3DMasterMix購自美國ABI公司；pEASY-BluntZeroCloningKit購自北 京Trans公司；SanPr巧柱式DNA膠回收試劑盒購自生工生物工程（上海）股份有限公司。
[0019]本發(fā)明中使用的主要儀器有：7500Rea^Time PCR System、如antSUidioTM 3D Digital PCR System、ProFlex? Base PCR儀等均購自美國ABI公司；Qsep 100全自動 單通道毛細管電泳分析儀購自中國臺灣Bioptic Inc公司；NanoDrop 2000c Software Installation Guide購自美國Thermo公司；G:B0X EF全自動凝膠成像分析儀購自英國 SYNGE肥公司。
[0020] 本發(fā)明中參照GenBank中上傳的新抱子蟲化SRS2基因（登錄號：U93870. 1)設計 檢測引物和巧光探針，相關領域技術人員可通過NCBI捜尋詢獲得。
[0021] 實例一、設計新抱子蟲病檢測引物和巧光探針 ①參考文獻，了解新抱子蟲化SRS2基因相關特性，下載GenBank中上傳的不同國家和 地區(qū)的新抱子蟲化SRS2基因序列，運用DNAMAN軟件對所有序列進行對比分析，找出化SRS2 基因的保守序列，在保守序列內(nèi)設計檢測引物和巧光探針，設計原則遵循Real-TimePCR引 物擴增產(chǎn)物長度為80~15化P。②運用PrimerExpress3.0和Oligo6. 24軟件根據(jù)新 抱子蟲化SRS2基因（登錄號：U93870. 1)保守區(qū)序列設計檢測引物化SRS2F/R和MGB巧光 探針化SRS2P，探針5'端標記FAM巧光報告基團，3'標記MGB巧光澤滅基團，擴增14化P的 目的片段。上游引物NCSRS2F為：5' -TAGACGAATGTAAAGAACGCC-3'，下游引物化SRS2R為： 5, -CAAATAGATGGTCTGTGCTGTC-3' ；巧光探針化SRS2P為：5' -FAM-TTATTCCGCCGTGTTTC-M GB-3'。
[002引實例二、制備目的基因片段陽性質(zhì)粒 ①先將設計的檢測引物委交于北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司合成，運用合 成的引物對新抱子蟲陽性DNA進行常規(guī)PCR擴增，常規(guī)PCR反應體系為25 y L = IOXPCR Buffer(Mg2+plus)2. 5yL，dNTP(2. 5mM)2yL，上、下游引物（IOpM)各IyL, Taq DNA聚合 酶巧U/ y L) 0. 15化，模板DNA 1. 5化，d地20補足25 y L。循環(huán)條件為：94°C預變性5min ; 94°C變性30s，56°C退火30s，72°C延伸30s，35次循環(huán)；72°C延伸5min。②取1 y L的6XDNA Loading Buffer加入到5 y L PCR產(chǎn)物中充分混勻，經(jīng)1. 5%的瓊脂糖凝膠、IOOV電泳40min 分析擴增條帶大小。若條帶大小為146bp則可繼續(xù)進行后續(xù)實驗（詳見附圖1)。③SanPrep 柱式DNA膠回收試劑盒回收、純化凝膠中陽性產(chǎn)物連入pEASY-Blunt Zero克隆載體，再將 克隆質(zhì)粒導入Transl-Tl感受態(tài)細胞中。運用Amp7LB固體培養(yǎng)基對Trans I-Tl感受態(tài)細 胞進行陽性篩選，成功導入克隆質(zhì)粒的感受態(tài)細胞會在固體培養(yǎng)基上生長成獨立的單個菌 落，未出現(xiàn)單個菌落則表示導入不成功，須重新連接。④操凈臺中挑取Amp7LB固體培養(yǎng)基 平板上生長的單個菌落接入Amp7LB液體培養(yǎng)基進行37°C、ISOrpm過夜培養(yǎng)（12~1化為 宜），吸出4mL菌液運用PlasmidPurificationKit提取菌體質(zhì)粒。⑥運用引物化SRS2F/ R對提取的菌體質(zhì)粒進行PCR擴增鑒定。將經(jīng)PCR鑒定為陽性的重組質(zhì)粒和克隆菌送至 北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司測序，將返回的測序結(jié)果與化SRS2基因（登錄號： U93870. 1)序列進行相似性比對。⑧當測序結(jié)果確定為新抱子蟲化SRS2基因序列后即成功 制備了目的基因陽性質(zhì)粒，此時再將探針化SRS2P交由北京鼎國昌盛生物技術有限責任公 司合成。
[0023] 實例S、3D數(shù)字PCR篩選最佳退火-延伸溫度和對擴增模板進行絕對定量分析 ①運用NCSRS2F/R和NCSRS2P對提取的某一陽性質(zhì)粒（32. 5ng/ y L)的10 6、10 \ 10 S 稀釋滴度進行3D數(shù)字PCR擴增，W篩選引物、探針的最佳退火-延伸溫度和確定參與反 應的模板濃度。②3D數(shù)字PCR反應體系為15yL:2 X 3D Master Mix 7. 5yL引物、探針 (I化M)各I y以質(zhì)粒模板2 y以（1地2〇補足15 y L。篩選的最佳循環(huán)條件為：96°C預變性 IOmin ;58°C退火-延伸2min，98°C變性30s，40次循環(huán)；60°C延伸2min。因此W 58°C作為 Real-Time PCR擴增的最佳退火-延伸溫度（詳見附圖2);得出106稀釋的質(zhì)粒模板中，參 與反應的模板濃度為6. 41 X IO3COPies/y L W此計算出該陽性質(zhì)粒實際參與擴增的模板 濃度為6. 41 X l〇9copies/ Ji L(詳見附圖3)。
[0024] 實例四、建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法 ①運用NCSRS2F/R和化SRS2P對陽性質(zhì)粒（32. 5ng/yL)的10°~10 9稀釋滴度進行Real-TimePCR擴增。通過均勻設計法優(yōu)化反應中模板濃度、引物濃度、延伸時間及循環(huán) 數(shù)等參數(shù)，建立新抱子蟲病Real-TimePCR檢測方法。②優(yōu)化Real-TimePCR反應體系為 25yL:2XReal-TimePCRMix12. 5yL引物、探針（IOpM)各 1 巧光校正液0. 5^以模 板DNA1yL，d地2〇補足25yL。優(yōu)化的擴增條件為：95°C預變性5min;95°C變性15s，58°C退火-延伸45s，45次