一種快速提高里氏木霉纖維素酶酶活的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，具體涉及利用一種快速提高里氏木霉纖維素酶酶活的 方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 植物細(xì)胞壁多糖主要包括纖維素和半纖維素，它的來源豐富、可再生，是生產(chǎn)可再 生生物燃料的理想原料。將植物細(xì)胞壁多糖，尤其是其中的主要成分一一纖維素完全降解 為可發(fā)酵的簡單寡糖和單糖如葡萄糖需要復(fù)雜的纖維素酶酶系協(xié)同作用。里氏木霉是一種 絲狀真菌，具有強大的分泌纖維素酶的能力。工業(yè)上，經(jīng)改造后的里氏木霉，其產(chǎn)纖維素酶 的產(chǎn)量可達(dá)到l〇〇g/L以上，因此，在降解植物細(xì)胞壁多糖以及相關(guān)應(yīng)用上具有重要的應(yīng)用 價值。
[0003] 里氏木霉的纖維素酶系包括兩個外切纖維素酶、五個內(nèi)切纖維素酶、一個葡 萄糖苷酶和三個裂解性多糖單加氧酶（lyticpolysaccharidesmonooxygenases,LPMOs， 即原GH61家族成員）。對這些纖維素酶的分泌表達(dá)的調(diào)控非常復(fù)雜，涉及到多個階段，如轉(zhuǎn) 錄、翻譯、轉(zhuǎn)運、蛋白折疊、胞外降解等以及多種關(guān)鍵因子。
[0004] 里氏木霉的纖維素酶對纖維素的降解，主要采取的是水解的作用方式，具體為：外 切纖維素酶從纖維素鏈的還原端（CBH1)和非還原端（CBH2)進行切割，而內(nèi)切纖維素酶則 從纖維素的無定形區(qū)進行切割，釋放出來的自由末端可稱為外切纖維素酶的底物；β-葡 萄糖苷酶將纖維二糖或纖維寡糖降解為葡萄糖。三種類型的纖維素酶協(xié)同作用，共同發(fā)揮 水解纖維素的作用。
[0005] 里氏木霉的纖維素酶中還包括微量的裂解性多糖單加氧酶，其中TrAA9A和 TrAA9B的性質(zhì)得到了初步的闡明，采取氧化裂解的方式對纖維素發(fā)生降解作用。
[0006] 由于裂解性多糖單加氧酶采取了不同于普通纖維素酶一樣的氧化裂解方式對纖 維素進行降解，其產(chǎn)生的纖維素鏈末端可稱為外切纖維素酶的作用位點，而裂解性多糖單 加氧酶所產(chǎn)生的氧自由基因其分子小，可攻擊高度結(jié)晶的纖維素分子，對這些位點的裂解 可打破高度結(jié)晶的纖維素結(jié)構(gòu)，而產(chǎn)生無定形區(qū)，作為內(nèi)切纖維素酶的作用位點?；诿钢?間的協(xié)同作用，過表達(dá)裂解性多糖單加氧酶有可能提高里氏木霉的纖維素酶酶活。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供過表達(dá)TrLPM09C的技術(shù)以快速提高里氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶 活的方法。
[0008]本發(fā)明的再一目的是提供高產(chǎn)纖維素酶酶活的重組里氏木霉。
[0009] 根據(jù)本發(fā)明的快速提高里氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶活的方法包括在里氏木霉中過表 達(dá)里氏木霉裂解性多糖單加氧酶9C基因TrLPM09C的步驟。
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的快速提高里氏木霉產(chǎn)纖維素酶酶活的方法，其中，所述TrLPM09C基 因的序列如SEQIDNo. 1所示，以pRS424為模板，通過將cbhl啟動子、TrLPM09C全長基因 片段以及cbhl終止子串聯(lián)拼接而成的TrLPM09C基因的過表達(dá)質(zhì)粒，cbhl啟動子的序列如SEQIDNo. 2所示，cbhl終止子的序列如SEQIDNo. 3所示。
[0011] SEQIDNo. 1 ：
[0012] ATGAAGCTTTGGATCGGCCTCTTGCTTTTGGGCCTCGCCTGCAGGGCAAGTGCCCACACAACTTTCACC ACGCTCTTCATCGACAAGAAGAACCAAGGGGATGGGACGTGCGTCCGGATGCCGTACGATGACAAGACGGCAACCAA CCCGGTCAAACCCATCACATCTTCAGACATGGCTTGTGGTGAGCATGCTTCTCTTACCAGGGCCGCCCGAATGGCAG TGAAGCTGGTTCGGTATTGACATATATCATCAGGTCGCAACGGTGGCGATCCGGTGCCATTCATTTGTTCGGCAAAG AAAGGATCTTTGCTCACCTTTGAATTTCGCCTCTGGCCCGATGCTCAGCAGCCCGGTAGCATTGATCCTGGCCACCT GGGTCCCTGCGCCGTGTACCTGAAGAAGGTTGACAACATGTTCTCGGACAGCGCCGCCGGTGGCGGCTGGTTCAAGA TCTGGGAGGACGGCTACGACTCCAAGACGCAGAAATGGTGCGTCGACCGCCTTGTCAAGAACAATGGCCTGCTCTCC GTGAGGCTTCCCAGGGGACTGCCTGCGGGATACTACATCGTGAGGCCCGAGATCCTCGCGCTGCACTGGGCTGCCCA TCGCGACGACCCGCAGTTCTACCTCGGTTGCGCCCAAATCTTCGTCGACAGCGACGTACGTGGTCCGCTGGAGATTC CTCGGAGACAGCAAGCGACTATCCCTGGGTATGTCAACGCCAAGACCCCAGGCCTCACGTTCGACATCTACCAGGAC AAGCTGCCTCCGTATCCCATGCCCGGCCCCAAGGTGTATATCCCCCCCGCGAAGGGGAACAAGCCCAATCAGGACCT GAACGCGGGCCGGCTCGTCCAGACTGACGGCCTCATCCCCAAGGACTGCTTGATCAAGAAGGCAAACTGGTGCGGCA GGCCCGTCGAGCCGTACTCGAGCGCACGCATGTGCTGGAGGGCCGTCAACGACTGCTACGCGCAGAGCAAGAAGTGC AGGGAGAGCTCTCCGCCCATAGGGCTGACCAACTGCGACCGCTGGAGCGACCACTGCGGCAAGATGGACGCGCTTTG CGAGCAGGAAAAGTACAAGGGGCCGCCCAAGTTCACCGAGAAGGAGTACGTTGTGCCGGCGCCGGGGAAGCTGCCGG AGATGTGGAACGACATCTTTGAGCGGCTTGAGCAGAACGGAACTTCTACCAAGTTTTTTTGA
[0013] SEQIDNo. 2(cbhl啟動子）：
[0014] GGGTTTGGAGCAATGTGGGACTTTGATGGTCATCAAACAAAGAACGAAGACGCCTCTTTTGCAAAGTTT TGTTTCGGCTACGGTGAAGAACTGGATACTTGTTGTGTCTTCTGTGTATTTTTGTGGCAACAAGAGGCCAGAGACAA TCTATTCAAACACCAAGCTTGCTCTTTTGAGCTACAAGAACCTGTGGGGTATATATCTAGAGTTGTGAAGTCGGTAA TCCCGCTGTATAGTAATACGAGTCGCATCTAAATACTCCGAAGCTGCTGCGAACCCGGAGAATCGAGATGTGCTGGA AAGCTTCTAGCGAGCGGCTAAATTAGCATGAAAGGCTATGAGAAATTCTGGAGACGGCTTGTTGAATCATGGCGTTC CATTCTTCGACAAGCAAAGCGTTCCGTCGCAGTAGCAGGCACTCATTCCCGAAAAAACTCGGAGATTCCTAAGTAGC GATGGAACCGGAATAATATAATAGGCAATACATTGAGTTGCCTCGACGGTTGCAATGCAGGGGTACTGAGCTTGGAC ATAACTGTTCCGTACCCCACCTCTTCTCAACCTTTGGCGTTTCCCTGATTCAGCGTACCCGTACAAGTCGTAATCAC TATTAACCCAGACTGACCGGACGTGTTTTGCCCTTCATTTGGAGAAATAATGTCATTGCGATGTGTAATTTGCCTGC TTGACCGACTGGGGCTGTTCGAAGCCCGAATGTAGGATTGTTATCCGAACTCTGCTCGTAGAGGCATGTTGTGAATC TGTGTCGGGCAGGACACGCCTCGAAGGTTCACGGCAAGGGAAACCACCGATAGCAGTGTCTAGTAGCAACCTGTAAA GCCGCAATGCAGCATCACTGGAAAATACAAACCAATGGCTAAAAGTACATAAGTTAATGCCTAAAGAAGTCATATAC CAGCGGCTAATAATTGTACAATCAAGTGGCTAAACGTACCGTAATTTGCCAACGGCTTGTGGGGTTGCAGAAGCAAC GGCAAAGCCCCACTTCCCCACGTTTGTTTCTTCACTCAGTCCAATCTCAGCTGGTGATCCCCCAATTGGGTCGCTTG TTTGTTCCGGTGAAGTGAAAGAAGACAGAGGTAAGAATGTCTGACTCGGAGCGTTTTGCATACAACCAAGGGCAGTG ATGGAAGACAGTGAAATGTTGACATTCAAGGAGTATTTAGCCAGGGATGCTTGAGTGTATCGTGTAAGGAGGTTTGT CTGCCGATACGACGAATACTGTATAGTCACTTCTGATGAAGTGGTCCATATTGAAATGTAAGTCGGCACTGAACAGG CAAAAGATTGAGTTGAAACTGCCTAAGATCTCGGGCCCTCGGGCCTTCGGCCTTTGGGTGTACATGTTTGTGCTCCG GGCAAATGCAAAGTGTGGTAGGATCGAACACACTGCTGCCTTTACCAAGCAGCTGAGGGTATGTGATAGGCAAATGT TCAGGGGCCACTGCATGGTTTCGAATAGAAAGAGAAGCTTAGCCAAGAACAATAGCCGATAAAGATAGCCTCATTAA ACGGA