ATGAGCTAGTAGGCAAAGTCAGCGAATGTGTATATATAAAGGTTCGAGGTCCGTGCCTCCCTCATGCTCTCC CCATCTACTCATCAACTCAGATCCTCCAGGAGACTTGTACACCATCTTTTGAGGCACAGAAACCCAATAGTCAACCG CGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT
[0015]SEQIDNo. 3(cbhl終止子）
[0016]AGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCATGACGGCGGCGGGAGC TACATGGCCCCGGGTGATTTATTTTTTTTGTATCTACTTCTGACCCTTTTCAAATATACGGTCAACTCATCTTTCAC TGGAGATGCGGCCTGCTTGGTATTGCGATGTTGTCAGCTTGGCAAATTGTGGCTTTCGAAAACACAAAACGATTCCT TAGTAGCCATGCATTTTAAGATAACGGAATAGAAGAAAGAGGAAATTAAAAAAAAAAAAAAAACAAACATCCCGTTC ATAACCCGTAGAATCGCCGCTCTTCGTGTATCCCAGTACCACGGCAAAGGTATTTCATGATCGTTCAATGTTGATAT TGTTCCCGCCAGTATGGCTCCACCCCCATCTCCGCGAATCTCCTCTTCTCGAACGCGGTAGTGGCGCGCCAATTGGT AATGACCCATAGGGAGACAAACAGCATAATAGCAACAGTGGAAATTAGTGGCGCAATAATTGAGAACACAGTGAGAC CATAGCTGGCGGCCTGGAAAGCACTGTTGGAGACCAACTTGTCCGTTGCGAGGCCAACTTGCATTGCTGTCAAGACG ATGACAACGTAGCCGAGGACCGTCACAAGGGACGCAAAGTTGTCGCGGATGAGGTCTCCGTAGATGGCATAGCCGGC AATCCGAGAGTAGCCTCTCAACAGGTGGCCTTTTCGAAACCGGTAAACCTTGTTCAGACGTCCTAGCCGCAGCTCAC CGTACCAGTATCGAGGATTGACGGCAGAATAGCAGTGGCTCTCCAGGATTTGACTGGACAAAATCTTCCAGTATTCC CAGGTCACAGTGTCTGGCAGAAGTCCCTTCTCGCGTGCGAGTCGAAAGTCGCTATAGTGCGCAATGAGAGCACAGTA GGAGAATAGGAACCCGCGAGCACATTGTTCAATCTCCACATGAATTGGATGACTGCTGGGCAGAATGTGCTGCCTCC AAAATCCTGCGTCCAACAGATACTCTGGCAGGGGCTTCAGATGAATGCCTCTGGGCCCCCAGATAAGATGCAGCTCT GGATTCTCGGTTACGATGATATCGCGAGAGAGCACGAGTTGGTGATGGAGGGGACGAGGAGGCATAGGTCGGCCGCA GGCCCATAACCAGTCTTGCACAGCATTGATCTTCCTCACGAGGAGCTCCTGATGCAGAAACTCCTCCATGTTGCTGA TTGGGTTGAGAATTTCATCGCTCCTGGATCGTATGGTTGCTGGCAAGACCCTGCTTAACCGTGCCGTGTCATGGTCA TCTCTGGTGGCTTCGTCGCTGGCCTGTCTTTGCAATTCGACAGCAAATGGTGGAGATCTCTCTATCGTGACAGTCAT GGTAGCGATAGCTAGGTGTCGTTGCACGCACATAGGCCGAAATGCGAAGTGGAAAGAATTTCCCGGCGCGGAATGAA GTCTCGTCATTTTGTACTCGTACTCGACACCTCCACCGAAGTGTT根據(jù)本發(fā)明的【具體實施方式】，設計引 物，從里氏木霉TU-6的基因組DNA中擴增cbhl基因啟動子片段、TrLPM09C全長基因片段 和cbhl終止子，同時用Kpnl、SacI將pRS424質粒載體進行雙酶切，電泳回收這四個片段。 將這四個片段同時轉化釀酒酵母AH109菌株，由于在引物設計時，加入了末端的互補序列， 因此PRS424和這三個外源片段可以通過釀酒酵母的體內重組無縫拼接起來。挑取篩選平 板上的陽性克隆，通過PCR及質粒測序的方法驗證這三個外源片段的插入。經驗證這三個 外源片段同時且正確拼接的質粒即為受cbhl啟動子調控的、能過表達TrLPM09C的重組質 粒。將重組轉化子接種于土豆培養(yǎng)基平板上產孢，將IX107孢子接種到100ml以葡萄糖作 為唯一碳源的MM-glucose培養(yǎng)基中，并于30°C，180rpm培養(yǎng)3天。將菌絲過濾、無菌水洗 滌并轉移至l〇〇ml以微晶纖維素Avicel做唯一碳源的MM_Avicel培養(yǎng)基中，繼續(xù)于30°C， 180rpm培養(yǎng)7天。
[0017] 本發(fā)明通過對里氏木霉的TrLPM09C基因進行過表達，獲得了纖維素酶酶活顯著 提高的轉化子。轉化子在MM-Avicel中培養(yǎng)7天后，其纖維素酶的濾紙酶活0. 21U/ml，CMC 酶活0. 40U/ml，較出發(fā)菌株均有一定程度的提高。
【附圖說明】
[0018] 圖1為PLPM09C質粒構建及其作用示意圖。
[0019] 圖2顯示TrLPM09C在里氏木霉RUT-C30基因組的整合及表達鑒定，A:PCR檢測 TrLPMO表達盒在里氏木霉基因組中的插入，1，DNA分子量標準；2,水對照；3,RUT-C30出發(fā) 菌株；4-13,轉化子1-10。B:SDS-PAGE電泳檢測重組TrLPMO的表達。1，蛋白質分子量標 準；2,RUT-C30出發(fā)菌株；3-7 :轉化子1-5。
[0020] 圖3顯示RUT-C30和轉化子（Transformant-Ι)的纖維素酶酶活比較.A:濾紙酶 酶活；B:外切酶CBHI酶活；C:CMC酶活；D:葡萄糖苷酶酶活。
【具體實施方式】
[0021] 實施例1TrLPM09C基因進行過表達的重組質粒pLPM09C的構建
[0022] 通過構建PLPM09C重組質粒，轉入里氏木霉中，在cbhl啟動子的驅動下轉錄并合 成LPM09C蛋白分泌至胞外。pCrel-i的質粒構建示意圖如圖1所示。
[0023] cbhl啟動子的擴增
[0024]以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以PcbhlpFl(5'-GCGTAATACGACTCACTATA GGGCGAATTGGCGGCCGCGGGTTTGGAGCAATGTGGGAC-3'）和PcbhlpRl(5,-CGGAGCTGGATCCGAATTC GTCGACCTCGAGGGTACCAGCACGAGCTGTGGCCAAGAAG-3'）為引物對cbhl基因啟動子進行擴增。 PCR反應條件為：95°CX5分鐘->94°CX0.5分鐘，55°CX0.5分鐘，，72°CX2分鐘，35個 循環(huán)->72°CX10分鐘_>結束反應。在1 %瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的目的條帶， 純化DNA。
[0025] TrLPM09C全長基閔片段的擴增
[0026]以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以PLPM09CF1 (5'-CGTCATCTCGGCCTTCTTGGC CACAGCTCGTGCTCACACAACTTTCACCACGCTCTTC-3'）和PLPM09CR1(5,-ATCTACCGGTGCGTCAGGCT TTCGCCACGGAGCTTCAAAAAAACTTGGTAGAAGTTCCG-3'）為引物對反向的TrLPM09C全長基因進 行擴增。PCR反應條件為：95°CX5分鐘->94°CX0.5分鐘，55°CX0.5分鐘，，72°CX1.5 分鐘，35個循環(huán)->72°CX10分鐘_>結束反應。在1%瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的 目的條帶，純化DNA。
[0027] cbhl終lh子片段的擴增
[0028]以里氏木霉Tu-6 的基因組DNA為模板，以PcbhltFl(5,-TCGTGCTGGTACCCTCGAGGTC GACGAATTCGGATCCAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGAC-3'）和PcbhltRl(5,-ATTAACCCTCACTAAAGGGAA CAAAAGCTGGCGGCCGCAACACTTCGGTGGAGGTGTCG-3'）為引物對正向的cbhl終止子進行擴增。 PCR反應條件為：95°CX5分鐘->94°CX0.5分鐘，55°CX0.5分鐘，，72°CXI分鐘，35個 循環(huán)->72°CX10分鐘_>結束反應。在1 %瓊脂糖膠上電泳，切下PCR產物中的目的條帶， 純化DNA。
[0029]DLPM09C質粒的構律
[0030] 將pRS424質粒用KpnI、SacI雙酶切，電泳、回收線性化質粒載體。將其和cbhl啟 動子、LPM09C基因、cbhl終止子DNA片段按1:3:3:3的摩爾比用氯化鋰法共同轉化釀酒酵 母AH109的感受態(tài)細胞，涂布在SD-Trp培養(yǎng)基上，30°C靜置培養(yǎng)48h。對酵母菌落做菌落 PCR，以鑒定三個片段是否已經連接到pRS424上。將PCR鑒定為陽性的酵母菌落挑取并接 種于3mlYH)培養(yǎng)基上，30°C、180rpm振搖培養(yǎng)過夜，提取質粒。將重組質粒轉化大腸桿菌Transl-Tl感受態(tài)細胞，涂布于含100μg/ml氨芐的LB瓊脂平板上，37°C靜置培