而不是對(duì)本發(fā)明的限制。
[0031] 本發(fā)明的脂肪酶基因lipase7來(lái)自于基因組測(cè)序的海洋放線菌（Pseudonocardia antitumoralis)SCSI0 01299,該菌保存在中國(guó)科學(xué)院南海海洋研究所實(shí)驗(yàn)室。
[0032] 實(shí)施例1:脂肪酶基因lipase7引物設(shè)計(jì)及開放閱讀框邊界確定
[0033]提取放線菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299 的基因組DNA，經(jīng)測(cè) 序驗(yàn)證無(wú)誤后，利用生物信息學(xué)手段對(duì)基因組進(jìn)行注釋，分析其中的脂肪酶基因，確定了其 中脂肪酶基因lipase7的開放閱讀框，其核苷酸序列如SEQIDNO. 1所示，全長(zhǎng)為927bp(從 起始密碼子到終止密碼子），其編碼的脂肪酶LIPASE7的氨基酸序列如SEQIDN0. 2所示， 共308個(gè)氨基酸；該基因是一個(gè)全新的脂肪酶基因，與其它脂肪酶基因序列的最大相似度 為42%。根據(jù)分析得到的脂肪酶基因lipase7序列，設(shè)計(jì)引物如下：正向引物：5' -CAT^SA TCCGTGAGCCGACACCTCGATCC-3'，下劃線部分為BamHI酶切位點(diǎn)；反向引物：5'-CCGCTCGA CTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3'，下劃線部分為XhoI酶切位點(diǎn)。
[0034] 實(shí)施例2 :脂肪酶基因lipase7的克隆及載體構(gòu)建
[0035] 2. 1PCR擴(kuò)增
[0036]將上述設(shè)計(jì)的引物（正向引物：5，-CATGGATCCGTGAGCCGACACCTCGATCC-3，，反 向引物：5' -CCGCTCGAGTCAGTGTTCCTCGGTGTCGG-3,)送至上海生物工程有限公司合成引 物，合成的引物使用TE稀釋到10μΜ，提取放線菌（Pseudonocardiaantitumoralis)SCSI0 01299的總DNA作為DNA模板，建立如表1所示反應(yīng)體系：
[0037] 表1PCR反應(yīng)體系
[0038]
[0039] 使用以下PCR擴(kuò)增程序擴(kuò)增脂肪酶基因lipase7 :95°C變性lOmin;95°C變性 lmin，55~65°C退火30s，72°C延伸lmin20s，進(jìn)行30個(gè)循環(huán)；72°C延伸lOmin，冷卻到18°C。
[0040] 將PCR產(chǎn)物在0. 8 %瓊脂糖凝膠中，120V電壓下電泳20min，置于凝膠成像系統(tǒng)中 觀察?；厥?00bp左右的條帶。PCR產(chǎn)物按照膠回收試劑盒的方法進(jìn)行回收，使用20μL無(wú) 菌水洗脫，得到純化回收的PCR產(chǎn)物。
[0041] 2.2酶切
[0042] 將純化回收的PCR產(chǎn)物使用以下體系進(jìn)行雙酶切，酶切時(shí)間lh。酶切體系為：BamH 2yL，XhoI2yL，DNA〈0. 3yg，滅菌的雙蒸水加至30yL。酶切后純化回收得到經(jīng)過雙酶切 的PCR產(chǎn)物。
[0043] 質(zhì)粒pET_28a(+)的雙酶切：挑取含有質(zhì)粒pET_28a(+)的大腸桿菌DH5α單菌落， 過夜培養(yǎng)。使用質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，用BamHI和Xhol按以下體系雙酶切，酶切時(shí)間 lh。酶切體系為：BamHI2yL，XhoI2yL，質(zhì)粒DNA〈lyg，滅菌的雙蒸水加至20yL。酶切 后純化回收得到經(jīng)過雙酶切的pET-28a(+)載體。
[0044] 上述雙酶切使用的限制性內(nèi)切酶為Thermo公司生產(chǎn)的快速內(nèi)切酶，酶切后的純 化回收使用核酸純化回收試劑盒（Magen，HipureGelPureDNAMicroKit)，質(zhì)粒提取試 劑盒為上海捷瑞生物工程有限公司的質(zhì)粒小量制備試劑盒，操作方法按其使用說明書。
[0045] 2. 3連接
[0046] 將經(jīng)過雙酶切的PCR產(chǎn)物和pET_28a(+)載體按以下體系進(jìn)行連接：雙酶切的PCR 產(chǎn)物5ul，雙酶切的pET-28a(+)載體lul，T4連接酶0. 5ul;連接使用的酶量為5U/5μL連 接體系，連接溫度為20°C，25min;由此得到連接產(chǎn)物。連接使用的Τ4連接酶購(gòu)自北京全式 金生物技術(shù)有限公司。
[0047] 2. 4轉(zhuǎn)化及篩選
[0048] 取10μL連接產(chǎn)物于50μL大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min，后于42°C 水浴鍋熱激90s，冰浴2min后加入500μLLB液體培養(yǎng)基，37°C200rpm轉(zhuǎn)速下，孵育培養(yǎng) 45min。取一定量的菌液涂布于含100μL/mL卡那霉素的LB平板，培養(yǎng)20h后挑選單菌落。 單菌落于5mLLB培養(yǎng)基中過夜培養(yǎng)后提取質(zhì)粒，進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證，酶切片段與基因大小相 同的即為陽(yáng)性克隆。
[0049] 2. 5基因核苷酸序列測(cè)定
[0050] 將篩選的正確陽(yáng)性克隆送至上海美吉生物醫(yī)藥有限公司進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與脂 肪酶基因lipase7核苷酸序列進(jìn)行比對(duì)，確認(rèn)是將脂肪酶基因lipase7(其核苷酸序列如 SEQIDNO. 1所示）插入到pET-28a(+)質(zhì)粒中，結(jié)果完全正確后確認(rèn)得到帶有脂肪酶基因 lipase7 的pET_28a(+)質(zhì)粒（pET_28a(+)_lipase7)，可用于進(jìn)行下一步試驗(yàn)。
[0051] 實(shí)施例3 :脂肪酶基因lipase7在大腸桿菌BL21 (DE3)中的高效表達(dá)
[0052] 3· 1大腸桿菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞制備
[0053] 1、將少量大腸桿菌BL21 (DE3)菌種接入5mLLB試管液中，37°C過夜搖培，250rpm;
[0054] 2、按1 %體積比的接種量將過夜搖培后的大腸桿菌BL21 (DE3)菌液接種到300ml LB搖瓶中，37 °C搖培3h(多300rpm);
[0055] 3、將培養(yǎng)好的搖瓶在冰水中迅速冷卻至0°C，分裝至冰預(yù)冷的離心管（50mL)，冰 置數(shù)分鐘；
[0056] 4、4°C，4000rpm離心lOmin回收細(xì)胞，去上清；
[0057] 5、用冰預(yù)冷的10mL0. 1M的CaCl2重懸細(xì)胞，4°C，4000rpm離心lOmin回收細(xì)胞；
[0058] 6、重復(fù)5,用10mL(λ1M的0&(：12重懸細(xì)胞，冰浴lh以上；
[0059] 7、4°C，4000rpm離心lOmin回收細(xì)胞；
[0060] 8、50mL原培養(yǎng)物用2mL含體積分?jǐn)?shù)15 %DMS0的0. 1MCaCl2來(lái)重懸，分裝于1. 5mL 離心管，50μL每管，-80°c保藏。由此得到大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞。
[0061] 3.2 轉(zhuǎn)化
[0062] 取實(shí)施例2中得到的pET-28a(+)-lipase7質(zhì)粒(λ5~lμL與50μL大腸桿菌 BL21 (DE3)感受態(tài)細(xì)胞混合，冰浴30min，于42°C水浴鍋熱激45s，冰浴2min后加入500μL LB液體培養(yǎng)基，37°C200rpm培養(yǎng)45h。培養(yǎng)物離心后涂布50μL/mL的卡那霉素LB平板， 培養(yǎng)過夜20h后挑選單菌。由此得到含有pET-28a(+)-lipaSe7的大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0063] 實(shí)施例4 :脂肪酶LIPASE7的表達(dá)和純化
[0064] 4. 1蛋白誘導(dǎo)
[0065] 含有pET-28a(+) -1ipase7的大腸桿菌BL21 (DE3)在LB培養(yǎng)基中37 °C培養(yǎng)至 0D600為0· 85左右，加IPTG至濃度0· 2mM，22°C培養(yǎng)16個(gè)小時(shí)。300mL菌液4000rpm，4°C離 心lOmin，收集菌體，用PBS緩沖液洗滌菌體2次，4000rpm，lOmin收集菌體。用30mL(50mM， pH7. 4)Tris-HCl緩沖液重懸菌體，超聲400w，超5s，停5s，破碎lOmin，4°C，lOOOOrmp離心 lOmin，收集上清。上清于-80°C冷凍過夜，冷凍干燥制備成酶粉。
[0066] 4. 2脂肪酶的純化
[0067] 用鎳離子親和層析柱對(duì)步驟4. 1中收集的上清進(jìn)行純化得純化的脂肪酶 LIPASE7(圖6)，純化的蛋白大小約35kD，符合理論預(yù)期。具體實(shí)施方案如下：使用20mM的 咪唑洗脫5個(gè)柱體積，45mM咪唑洗脫30個(gè)柱體積，最后使用100~lOOOmM咪唑洗脫5個(gè)柱 體積，收集中間3. 5mL。用脫鹽柱S印hadexG25進(jìn)行脫鹽，具體操作方法參照GE公司的操作 手冊(cè)進(jìn)行。
[0068] 4. 3脂肪酶LIPASE7酶活測(cè)定
[0069] 脂肪酶LIPASE7活力測(cè)定采用對(duì)硝基苯酚酯，具體方法如下：①配制lOmM的對(duì)硝 基苯酚酯；②在lmL反應(yīng)體系中加入940yLTris-HClbuffer(50mM，pH8. 5)，20yL乙醇， 10