μL濃度為0· 40~0· 86mg/mL脂肪酶LIPASE7純酶液；③于35°C下，3~5min后，410nm 測定吸光度。
[0070] 酶活單位定義：lmin內(nèi)水解對硝基苯酸酯，釋放1μπιο?對硝基苯酸所需的酶量定 義為一個酶活單位。
[0071] 實施例5 :脂肪酶LIPASE7的酶學(xué)性質(zhì)
[0072] 5. 1水解不同長度的對硝基苯酚酯
[0073] 按照4. 3的測定條件，比較脂肪酶LIPASE7作用不同長度的對硝基苯酚酯，結(jié)果如 圖1，說明脂肪酶LIPASE7對長鏈對硝基苯酚酯特異性差，而對于短鏈對硝基苯酚酯的作用 效果較好，最佳的底物是C6,即對硝基苯酸己酸酯。
[0074] 5. 2最適pH和pH穩(wěn)定性
[0075] 配制不同的緩沖溶液，這些緩沖溶液具有不同的pH，如表2所示，其濃度均為 50mM：
[0076] 表2不同緩沖體系的pH
[0077]
[0078] 將4. 3中測定條件（以對硝基苯酚己酸酯作為底物）所述的緩沖液（Tris-HCl buffer)按照表2中的緩沖溶液分別進行替換，測定不同PH的緩沖溶液對脂肪酶LIPASE7 的酶活力的影響，結(jié)果說明脂肪酶LIPASE7酶活在Tris-HClPH為7. 5時活性最高（圖2A)， PH高于8. 0、小于7. 0活性會急劇下降。
[0079] 過夜處理置于不同的緩沖液中的脂肪酶LIPASE7,按4. 3中測定條件（以對硝基苯 酚己酸酯作為底物）測定脂肪酶酶活，脂肪酶LIPASE7酶活在pH為8. 0緩沖液中穩(wěn)定性最 高（圖2B)。
[0080] 5. 3最適溫度和溫度穩(wěn)定性
[0081] 在ρΗ7· 5, 50mMTris-HCl作為緩沖溶液，按4. 3中的反應(yīng)混合液（以對硝基苯酚 己酸酯作為底物）置于10~60°Clh后，加入等量的脂肪酶LIPASE7在各自的溫度下反應(yīng) 3~5min，410nm測定酶活。結(jié)果說明，脂肪酶LIPASE7最適反應(yīng)溫度在20°C，高于20°C酶 活將會大大降低（圖3A)。
[0082] 將脂肪酶LIPASE7置于不同溫度（15~45°C)預(yù)處理lh，于20°C下，ρΗ7·5， 50mMTris-HCl的緩沖溶液中，按4. 3測定方法（以對硝基苯酚己酸酯作為底物）測定脂肪 酶LIPASE7酶活。結(jié)果說明，脂肪酶LIPASE7在20°C的穩(wěn)定性最好，隨著溫度升高，穩(wěn)定性 逐漸降低，45°C處理lh后酶活基本為0(圖3B)。
[0083] 5.4金屬離子抑制
[0084] 以50mMpH7. 0的Tris-HCl為溶劑配制不同金屬離子溶液，每種金屬離子濃度均 為2mM，將脂肪酶LIPASE7酶液在各種金屬離子溶液中37°C下處理lh;以不加金屬離子的 50mM、ρΗ7· 5的Tris-HCl溶液為對照（control)。再按照4. 3中的測定方法（以對硝基苯 酚己酸酯作為底物）測定酶活，結(jié)果見表3,Mn2+、Ca2+對脂肪酶LIPASE7酶活有促進作用， 其它金屬離子對脂肪酶LIPASE7活性均表現(xiàn)出抑制作用。
[0085] 表3金屬離子對lipase7酶活力的影響
[0086]
[0087] 5. 5有機溶劑和表面活性劑對脂肪酶活性的影響
[0088] 將脂肪酶LIPASE7加入到表4中的有機溶劑和表面活性劑溶液中處理12h(對照 為蒸餾水，其他溶液的濃度為體積分數(shù)），然后按照4. 3的測定方法（以對硝基苯酚己酸酯 作為底物）測定酶活。結(jié)果表明正庚烷對脂肪酶LIPASE7的活性有一定的促進作用，EDTA、 Tween-80、Tween-20、Triton-ΧΙΟΟ能極大地促進脂肪酶LIPASE7酶活，最高達到166. 54% ±0. 047,SDS抑制脂肪酶LIPASE7的活性。
[0089] 表4有機溶劑、表面活性劑對脂肪酶活性的影響
[0090]
[0091]
[0092] 實施例6 :脂肪酶LIPASE7在拆分（±)-2_氯丙酸甲酯、（±)-2_氯丙酸乙酯中的 應(yīng)用
[0093] 本法采用在水相中拆分（±)_2_氯丙酸甲酯、（±)_2_氯丙酸乙酯。
[0094] 1)在優(yōu)化的條件下，即在0. 5ml900mMPH8. 0的Tris-HCl緩沖溶液中，加入3uL 6mg/mL的脂肪酶LIPASE7純酶液，2% (v/v)的正癸醇，于20°C，200rpm條件下，拆分500mM 的（±)-2_氯丙酸甲酯，在60min內(nèi)可得到99%光學(xué)純度的（R)-2-氯丙酸甲酯，轉(zhuǎn)化率為 98. 28 %，產(chǎn)物產(chǎn)率為99. 86 % (圖4)。
[0095] 2)在優(yōu)化的條件下，即在0. 5ml900mMPH8. 5的Tris-HCL緩沖溶液中，加入10uL 6mg/mL的脂肪酶LIPASE7純酶液，2% (v/v)的正癸醇，于20°C，200rpm條件下，拆分500mM 的（±)-2_氯丙酸乙酯，在lOOmin內(nèi)可得到98%光學(xué)純度的（R)-2-氯丙酸乙酯，轉(zhuǎn)化率為 98. 77 %，產(chǎn)物產(chǎn)率為97. 77 % (圖5)。
[0096] 具體分析條件為：采用福立氣相色譜儀，配有手性柱（30mX0. 25mmCyclosilB chirlcolumn)和氫離子火焰檢測器。儀器分析條件設(shè)置為：注射器溫度220°C，檢測器溫 度250°C，載氣為N2,流速1. 2mL/min，采用梯度升溫進行分析：60°C保持lmin，20°C/min，
【主權(quán)項】
1. 一種脂肪酶LIPASE7,其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。2. -種編碼權(quán)利要求1所述的脂肪酶LIPASE7的脂肪酶基因lipase7。3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的脂肪酶基因lipase7,其特征在于，所述的脂肪酶基因 lipase7的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。4. 權(quán)利要求1所述的脂肪酶LIPASE7在制備手性（R)-2-氯丙酸甲酯或（R)-2-氯丙酸 乙酯中的應(yīng)用。5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，脂肪酶LIPASE7在拆分（±) -2-氯丙酸甲 酯制備得到（R)-2_氯丙酸甲酯中的應(yīng)用。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為：取脂肪酶LIPASE7于pH為 6. 0-9.0的緩沖液中，再加入（±)-2_氯丙酸甲酯及其助溶劑，進行反應(yīng)，得到（R)-2-氯丙 酸甲酯。7. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的應(yīng)用，其特征在于，脂肪酶LIPASE7在拆分（±) -2-氯丙酸乙 酯得到（R)-2-氯丙酸乙酯中的應(yīng)用。8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的應(yīng)用為：取脂肪酶LIPASE7于pH為 6. 0-9. 0的緩沖液中，再加入（±)-2_氯丙酸乙酯及其助溶劑，進行反應(yīng)，得到（R)-2-氯丙 酸乙酯。9. 根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的緩沖液為檸檬酸-檸檬酸鈉、 磷酸緩沖液、Tris-HCl和甘氨酸-NaOH緩沖液中的一種。10. 根據(jù)權(quán)利要求6或8所述的應(yīng)用，其特征在于，所述的助溶劑為正癸醇、正丁醇、乙 醇、異丙醇、環(huán)己酮、環(huán)己烷、正己烷、正庚烷和異辛烷中的一種。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種脂肪酶LIPASE7及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明從海洋放線菌(Pseudonocardia？antitumoralis)SCSIO？01299中克隆得到一個新的脂肪酶基因——脂肪酶基因lipase7，其核苷酸序列如SEQ？ID？NO.1所示，全長為927bp，其編碼的脂肪酶LIPASE7的氨基酸序列如SEQ？ID？NO.2所示，共包含308個氨基酸。通過克隆脂肪酶基因lipase7并將其連接表達載體pET-28a(+)后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，培養(yǎng)并誘導(dǎo)表達后，得到了重組表達的脂肪酶LIPASE7。脂肪酶LIPASE7作為催化劑拆分(±)-2-氯丙酸甲酯，可制備得到99％光學(xué)純度的(R)-2-氯丙酸甲酯；脂肪酶LIPASE7作為催化劑拆分(±)-2-氯丙酸乙酯，可得到98％光學(xué)純度的(R)-2-氯丙酸乙酯。脂肪酶LIPASE7具有穩(wěn)定性高、催化效率高的優(yōu)點，可用于生物醫(yī)藥、化妝品和精細化工等領(lǐng)域。
【IPC分類】C12N9/20, C12N15/55, C12P7/62, C12P41/00
【公開號】CN105238769
【申請?zhí)枴緾N201510713812
【發(fā)明人】胡云峰, 曹瑩瑩, 鄧盾, 孫愛君, 張云
【申請人】中國科學(xué)院南海海洋研究所
【公開日】2016年1月13日
【申請日】2015年10月27日