一種輔酶高效再生體系的構(gòu)建及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于基因工程及酶工程領(lǐng)域，具體涉及一種按密碼子優(yōu)化的博伊丁假絲酵 母菌甲酸脫氫酶基因序列合成方法，同時將其與氨基酸脫氫酶串聯(lián)到質(zhì)粒上并在大腸桿菌 中的表達，利用重組大腸桿菌進行全細胞轉(zhuǎn)化高效制備α-氨基丁酸的方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 非天然α-氨基酸是區(qū)別于能夠由生物體自身合成的22種天然α-氨基酸的一 大類氨基酸，它們具有重要的生物活性和生理作用，廣泛用于多肽、手性藥物以及生物堿等 化合物的合成。α-氨基丁酸是抑制人體神經(jīng)信息傳遞的非天然氨基酸，具有加強葡萄糖磷 酸酯酶的活性，促進腦細胞代謝的作用。α-氨基丁酸也是一種重要的化工原料和醫(yī)藥中間 體，已廣泛用于藥物的合成，如抗結(jié)核藥物鹽酸乙胺丁醇和抗癲癇藥物左乙拉西坦的合成， 市場巨大。
[0003]α-氨基丁酸的合成方法主要包括化學合成法、酶拆分法及酶轉(zhuǎn)化法三種。其中化 學法包括脫硫反應(yīng)、氨化水解反應(yīng)、丁酮酸還原法等，化學合成雖然操作簡單，但往往反應(yīng) 條件苛刻且易生成副產(chǎn)物，有時需要利用對環(huán)境有害的大量有機溶劑，如JefferyΕ.Α.等 利用電化學法制備得α-氨基丁酸，產(chǎn)率僅有48%，同時存在副產(chǎn)物谷氨酸。相比之下，微 生物法制備α-氨基丁酸具有特異性較強，條件溫和，對環(huán)境友好等優(yōu)點。并且隨著基因工 程技術(shù)的發(fā)展，構(gòu)建重組微生物合成非天然氨基酸代謝途徑已經(jīng)可以完成。目前，α-氨基 丁酸的微生物法制備主要通過細胞外酶轉(zhuǎn)化法，包括對消旋α-氨基丁酸進行酶法拆分制 備及以2- 丁酮酸為原料通過脫氫酶或轉(zhuǎn)氨酶來催化制備。
[0004] 專利CN102212567A構(gòu)建了以大宗化學品L-蘇氨酸為廉價底物，通過L-蘇氨酸脫 氨酶、L-氨基酸脫氫酶及輔酶再生系統(tǒng)的酶體系進行一步法制備α-氨基丁酸。以甲酸脫 氫酶作為輔酶NADH循環(huán)的轉(zhuǎn)化體系中，將底物甲酸或甲酸鹽催化生成C02，反應(yīng)中不產(chǎn)生任 何副產(chǎn)物，有利于α-氨基丁酸的分離提取，但甲酸脫氫酶存在酶活較低、價格昂貴等的問 題，使得NADH的再生速率已成為限制α-氨基丁酸轉(zhuǎn)化的主要因素。另外，以酶體系去進 行α-氨基丁酸的生產(chǎn)需要對產(chǎn)酶的重組菌進行細胞破碎，同時在轉(zhuǎn)化的過程中因輔因子 的損耗需要不斷地外源添加，進一步增加了α-氨基丁酸的生產(chǎn)成本。因此，有必要尋找一 種高效但成本低廉的制備α-氨基丁酸的方法。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的主要研究內(nèi)容：本發(fā)明在于按照大腸桿菌的密碼子偏好對博伊丁假絲 酵母菌甲酸脫氫酶基因序列（fdh，GenBankAccession N〇.AJ011046)進行密碼子優(yōu)化， 并合成這段基因。將合成的甲酸脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因構(gòu)建重組共表達載體 pET_28a-fdh+Bcldh、pET_28a-fdh+Rjpdh及pET-duet-fdh+Bsadh、pET-duet-fdh+Scvdh， 并將其轉(zhuǎn)化E. coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-fdh+Bcldh/BL21、 pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-fdh+Bsadh/BL21、pET-duet-fdh+Scvdh/BL21。同時將 L-蘇氨酸脫氨酶（ltd)基因利用分子技術(shù)進行克隆，構(gòu)建重組表達載體pET-28a-Ecltd和pET-28a-Seltd，并將其轉(zhuǎn)化E.coliBL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及 pET-28a-Ecltd/BL21。在不添加任何外源輔因子的條件下，利用全細胞轉(zhuǎn)化法對廉價底物 L-蘇氨酸進行轉(zhuǎn)化高效制備α-氨基丁酸，為α-氨基丁酸的工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種實際 有效策略。
[0006] 本發(fā)明的技術(shù)方案：
[0007] 1.甲酸脫氫酶的密碼子優(yōu)化
[0008] 將來源于博伊丁假絲酵母菌甲酸脫氫酶基因序列針對大腸桿菌的密碼子偏好進 行密碼子優(yōu)化，然后進行基因合成。
[0009] 2.甲酸脫氫酶引物設(shè)計
[0010] 根據(jù)密碼子優(yōu)化后的fdh基因序列，設(shè)計甲酸脫氫酶基因的PCR引物Ρ1和Ρ2以 及在pET-28a與L-氨基酸脫氫酶共表達的引物P3和P4。
[0011] P1 :5'-ACCGGGATCCATGAAAATCGTTCTGGTTCTG-3'（BamHI)
[0012] P2 :5'-CGCGTCGACTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3'（SalI)
[0013] P3 :5'-ACATGCATGCCGATCCCGCGAAATTAATAC-3'（Sph I)
[0014]P4 :5' -GAAGATCTTTATTTTTTGTCGTGTTTACC-3'（BglII)
[0015] 3. L-氨基酸脫氫酶及L-蘇氨酸脫氨酶引物設(shè)計
[0016] 根據(jù)不同來源的蘇氨酸脫氨酶的基因序列設(shè)計引物。
[0017] PEcltdF :5'-ACCGGGATCCATGGCTGACTCGCAACCCCT-3'（BamH I)
[0018] PEcltdR :5'-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAAAAAGAACCTG-3'（Hind III)
[0019]PSeltdF:5'-ACCGGGATCCATGGCGGAATCTCAACCTCT-3'（BamH I)
[0020] PSeltdR :5'-CCCAAGCTTTTAACCCGCCAGAAAGAACC-3'（HindIII)
[0021] 根據(jù)不同來源的氨基酸脫氫酶的基因序列設(shè)計引物。
[0022] PBcldhF :5'-CGGGATCCATGACATTAGAAATCTTCG-3'（BamHI)
[0023] PBcldhR :5'-CGAGCTCTTAGCGACGGCTAATAATATC-3'（SacI)
[0024] PRjpdhF :5'-CGGGATCCATGACTCTCACCGCGGAAC-3'（BamH I)
[0025]PRjpdhR :5'-CGAGCTCCTACCTGGCTGCAGCGATG-3'（SacI)
[0026]PBsadhF:5'-GGGGTACCATGATCATAGGGGTTCCT-3'（Κρη I)
[0027] PBsadhR :5'-CCGCTCGAGTTAAGCACCCGCCACAGATG-3'（Xho I)
[0028]PScvdhF :5'-GGAATTCCATATGGTGACCGACGTAAACGG-3'（NdeI)
[0029] PScvdhR :5'-CGAGCTCTCACGGCCGGGGACGGGCCT-3'（Xho I)
[0030] 4.重組菌的構(gòu)建
[0031] 以染色體DNA或合成的密碼子優(yōu)化甲酸脫氫酶DNA作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的 引物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回 收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度。采用相同的限制性內(nèi)切酶對載體pET-28a或者pET-Duet和 純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純 化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21的 感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入氨芐霉素或卡那霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培 養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0032] 之后以連上pET_28a的甲酸脫氫酶質(zhì)粒為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的帶啟動子的引 物、PCR擴增條件和擴增體系進行PCR。采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收， 電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度。采用相同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上L-氨基酸脫氫酶的載體 pET-28a-ldh和純化的PCR產(chǎn)物進行雙酶切，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對 酶切產(chǎn)物進行純化和回收。將載體和PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入 E.coliBL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性克隆于加入卡那霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振 蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確后，將菌液加入甘油于-40°C冰箱保存。
[0033] 以pET-Duet為甲酸脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶的共表達載體時。先以染色體DNA 作為模板，根據(jù)預(yù)先設(shè)計好的引物、PCR擴增條件和擴增體系進行L-氨基酸脫氫酶的基因 PCR，采用凝膠回收試劑盒對PCR產(chǎn)物進行純化和回收，電泳檢驗回收產(chǎn)物的濃度。采用相 同的限制性內(nèi)切酶對已經(jīng)連上pET-Duet的甲酸脫氫酶質(zhì)粒載體和純化的PCR產(chǎn)物進行雙 酶切以，電泳檢驗酶切產(chǎn)物，并用凝膠回收試劑盒對酶切產(chǎn)物進行純化和回收。將載體和 PCR產(chǎn)物用T4DNA連接酶過夜連接，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入E.coliBL21的感受態(tài)細胞，挑取陽性 克隆于加入氨芐霉素的10mL的LB培養(yǎng)基中，37°C振蕩培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒，酶切驗證正確 后，將菌液加入甘油于_40°C冰箱保存。
[0034] 5.重組菌的培養(yǎng)
[0035]將構(gòu)建好的工程菌接種于LB培養(yǎng)基中進行活化，次日轉(zhuǎn)接于發(fā)酵培養(yǎng)基中，IPTG誘導(dǎo)表達，離心收集菌體。發(fā)酵培養(yǎng)基中具備微生物生長所需的營養(yǎng)成分，即碳源、氮源、無 機鹽、生長因子等。碳源包括葡萄糖、甘油、糖蜜、淀粉、淀粉水解物等；氮源主要有玉米漿、 酵母膏、酵母粉、蛋白胨、酪蛋白水解物、其他含氮有機物尿素、氨基酸等以及含氮無機物氨 水、硫酸銨和氯化銨等。以及磷酸鹽（磷源）和硫酸鹽（硫源）等。另外，培養(yǎng)基中還適量 加入金屬離子。
[0036] 6.重組菌全細胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)α-氨基丁酸
[0037]將獲得的菌體用pH 7. 5的50mM ΡΒ緩沖液洗滌兩次，再加入pH 6. 0-8. 0的50mM PB緩沖液重懸，然后于30-42°C不同溫度下加入底物L-蘇氨酸及甲酸或甲酸鹽，以20%甲 酸或者5M氨水控制pH在6.0