然后進(jìn)樣。色譜柱：(1加〇8〇丨1(： 18(5 4 1，25011111^4.6臟），流動(dòng)相：0.051醋酸鈉緩沖液： 甲醇-63:35,檢測(cè)器：UVDetector，檢測(cè)波長(zhǎng)：338nm，柱溫：40°C，進(jìn)樣量：20yL，流速： 1. 0ml/min〇
[0101] [2]最適培養(yǎng)基：經(jīng)過(guò)HPLC測(cè)定，發(fā)現(xiàn)L-蘇氨酸到α-氨基丁酸在TB基、TY基、 TYG基及GP基發(fā)酵后的全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)率分別為88 %，76 %，79 %，84%。因胰蛋白胨及酵母 提取物的成本相比于葡萄糖來(lái)說(shuō)較高，因此確定最佳的發(fā)酵培養(yǎng)基為GP培養(yǎng)基。
[0102] [3]全細(xì)胞轉(zhuǎn)化最適條件：在GP培養(yǎng)基條件下，待終濃度為ImM的IPTG對(duì)重組菌 在16°C搖床24h誘導(dǎo)表達(dá)后，4°C，8000r/min離心10min收集菌體，用100mLpH7. 0的50mM PB緩沖液洗滌二次，重懸于pH分別為6. 0、7. 0、8. 0的等體積的50mMPB緩沖液中。向該體 系中投入1ML-蘇氨酸和0. 1% (v/V)tween-80,分別置于30°C、37°C及42°C搖床中進(jìn)行轉(zhuǎn) 化，轉(zhuǎn)化過(guò)程中實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)pH值，并以20%甲酸或者5M氨水調(diào)節(jié)使pH恒定。分不同時(shí)間取 樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析。得到全細(xì)胞轉(zhuǎn)化緩沖液pH為7. 5、搖床溫 度為30°C的轉(zhuǎn)化率最高，達(dá)到98%，α-氨基丁酸的產(chǎn)率為69. 2g/L。
[0103] [4]發(fā)酵罐上全細(xì)胞轉(zhuǎn)化：在GP培養(yǎng)基條件下，接種量8%，300r/min、l.Ovvm通 氣量條件下培養(yǎng)2-3h，之后加入終濃度為0. 5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h 后，4°C，8000r/min離心10min收集菌體，用pH7. 0的50mMPB緩沖液洗滌二次，重懸于培 養(yǎng)時(shí)同等體積的pH7. 0的50mMPB緩沖液中，向該體系中投入1ML-蘇氨酸和0. 1% (v/ v)tween-80,于30°C、300r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并以20%甲酸或者5M氨水調(diào)節(jié)使pH恒定7. 0。 待轉(zhuǎn)化18h后取樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分析，得到α-氨基丁酸的產(chǎn)率 為 81. 5g/L。
[0104] 實(shí)施例9:串聯(lián)甲酸脫氫酶及L-苯丙氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)α-氨基丁 酸
[0105] 將重組菌pET-28a_Ecltd/BL21和串聯(lián)有L-苯丙氨酸脫氫酶的 pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37°C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L 的GP基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量l.Ovvm。培養(yǎng)2-3h后加入 終濃度為〇.5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心lOmin收 集菌體，用pH7. 0 的50mMPB緩沖液分別將pET-28a-Ecltd/BL21 和pET-28a-fdh+Rjpdh/ BL21兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH7.0的50mMPB緩沖液中， 向該體系中投入說(shuō)1^-蘇氨酸和1%(￥八）甲苯，于30°(：、30(^/1^11進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并以20%甲 酸或者5M氨水調(diào)節(jié)使pH6. 0。待轉(zhuǎn)化18h后取樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC分 析（同實(shí)施例8中的HPLC方法），得到α-氨基丁酸的產(chǎn)率為36. 2g/L。
[0106] 實(shí)施例10:串聯(lián)甲酸脫氫酶及L-丙氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)α-氨基丁 酸
[0107] 將重組菌pET-28a_Seltd/BL21和串聯(lián)有L-丙氨酸脫氫酶的 pET-duet-fdh+Bsadh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37°C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L 的GP基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量l.Ovvm。培養(yǎng)2-3h后加入 終濃度為〇. 5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心lOmin收 集菌體，用pH7. 0 的 50mMPB緩沖液分別將pET-28a-Seltd/BL21 和pET-duet-fdh+Bsadh/ BL21兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH7. 0的50mMPB緩沖液中， 向該體系中投入1ML-蘇氨酸和0. 2% (v/v)曲拉通X100,于30°C、300r/min進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并 以20%甲酸或者5M氨水調(diào)節(jié)使pH8. 0。待轉(zhuǎn)化18h后取樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后 經(jīng)HPLC分析（同實(shí)施例8中的HPLC方法），得到α-氨基丁酸的產(chǎn)率為52. 5g/L。
[0108] 實(shí)施例11:串聯(lián)甲酸脫氫酶及L-纈氨酸脫氫酶重組菌全細(xì)胞轉(zhuǎn)化產(chǎn)α-氨基丁 酸
[0109] 將重組菌pET-28a-Seltd/BL21和串聯(lián)有L-纈氨酸脫氫酶的 pET-duet-fdh+Scvdh/BL21利用LB培養(yǎng)基活化，37°C、160r/min培養(yǎng)過(guò)夜后分別轉(zhuǎn)接于2L 的GP基中。接種量8%，培養(yǎng)溫度37°C，轉(zhuǎn)速300r/min，通氣量l.Ovvm。培養(yǎng)2-3h后加入 終濃度為〇. 5mM的IPTG，誘導(dǎo)溫度降低為28°C，誘導(dǎo)16h后，4°C，8000r/min離心lOmin收 集菌體，用pH7. 0 的 50mMPB緩沖液分別將pET-28a-Seltd/BL21 和pET-duet-fdh+Scvdh/ BL21兩種重組大腸桿菌洗滌二次，重懸于培養(yǎng)時(shí)同等體積的pH7. 0的50mMPB緩沖液中， 向該體系中投入說(shuō)1^-蘇氨酸和0.5%(￥八)0^8，于30°(：、30(^/1^11進(jìn)行轉(zhuǎn)化，并以20% 甲酸或者5M氨水調(diào)節(jié)使pH7. 0。待轉(zhuǎn)化18h后取樣，離心并用0. 22μm濾膜過(guò)濾后經(jīng)HPLC 分析（同實(shí)施例8中的HPLC方法），得到α-氨基丁酸的產(chǎn)率為45.lg/L。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大腸桿菌制備a -氨基丁 酸的方法，其特征包括以下內(nèi)容： 1) 將來(lái)源于博伊丁假絲酵母菌甲酸脫氫酶基因序列針對(duì)大腸桿菌的密碼子偏好進(jìn)行 密碼子優(yōu)化，然后進(jìn)行基因合成。 2) 將合成的甲酸脫氫酶基因與L-氨基酸脫氫酶基因構(gòu)建重組共表達(dá)載體 pET_28a-fdh+Bcldh、pET_28a-fdh+Rjpdh 及 pET-duet-fdh+Bsadh、pET-duet-fdh+Scvdh， 并將其轉(zhuǎn)化E. coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-fdh+Bcldh/BL21、 pET-28a-fdh+Rjpdh/BL21、pET-duet-fdh+Bsadh/BL21、pET-duet-fdh+Scvdh/BL21。同時(shí)將 L-蘇氨酸脫氨酶（ltd)基因利用分子技術(shù)進(jìn)行克隆，構(gòu)建重組表達(dá)載體pET-28a-Ecltd和 pET-28a-Seltd，并將其轉(zhuǎn)化E. coli BL21，成功構(gòu)建了基因工程菌pET-28a-Ecltd/BL21及 pET-28a_Ecltd/BL21。 3) 使用重組大腸桿菌在不同的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)優(yōu)化，用于a-氨基丁酸的 全細(xì)胞轉(zhuǎn)化，利用pH7. 0的50mM PB緩沖液洗滌細(xì)胞然后將細(xì)胞重新懸浮于pH6. 0-8. 0的 50mM PB緩沖液中，在不加入任何輔因子的情況下，加入0.8M L-蘇氨酸、0.8M甲酸銨及 0. 1-1 %的增加細(xì)胞通透性的表面活性劑，利用20%的甲酸及5M氨水調(diào)節(jié)使轉(zhuǎn)化的pH保持 在6. 0-8. 0之間，并控制轉(zhuǎn)化的溫度在30-42°C之間，制備得到a -氨基丁酸。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大 腸桿菌制備a -氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的甲酸脫氫酶密碼子優(yōu)化針對(duì)：但不限 于，大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大 腸桿菌制備a-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-氨基酸脫氫酶選自：但不限于，芽 孢桿菌來(lái)源的L-亮氨酸脫氫酶、芽孢桿菌來(lái)源的L-丙氨酸脫氫酶、鏈霉菌來(lái)源的L-纈氨 酸脫氫酶、紅球菌來(lái)源的L-苯丙氨酸脫氫酶。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大 腸桿菌制備a-氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的L-蘇氨酸脫氨酶選自：但不限于，大 腸桿菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶、鼠傷寒沙門(mén)（氏）菌來(lái)源的L-蘇氨酸脫氨酶。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大 腸桿菌制備a -氨基丁酸的方法，其特征在于，所述的增加細(xì)胞通透性的表面活性劑為：但 不限于，吐溫80、甲苯、曲拉通X100、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB)。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大 腸桿菌 制備a -氨基丁酸的方法，其特征在于不向轉(zhuǎn)化反應(yīng)液中添加任何輔因子。
【專利摘要】本發(fā)明是一種串聯(lián)氨基酸脫氫酶及密碼子優(yōu)化的甲酸脫氫酶重組大腸桿菌制備α-氨基丁酸的方法。首先，按照大腸桿菌的密碼子偏好對(duì)博伊丁假絲酵母菌甲酸脫氫酶基因序列進(jìn)行密碼子優(yōu)化。對(duì)甲酸脫氫酶密碼子優(yōu)化后可以顯著提高其在大腸桿菌中的表達(dá)量，增加α-氨基丁酸的產(chǎn)量，同時(shí)共表達(dá)甲酸脫氫酶及L-氨基酸脫氫酶于大腸桿菌中可以促進(jìn)輔因子在菌體胞內(nèi)的循環(huán)，可以不需要添加任何外源輔因子，另外利用全細(xì)胞轉(zhuǎn)化大宗化學(xué)品L-蘇氨酸生產(chǎn)α-氨基丁酸過(guò)程簡(jiǎn)單快捷，成本低廉。在5L發(fā)酵罐中該方法所得的α-氨基丁酸產(chǎn)量可達(dá)81.5g/L，為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一種實(shí)際有效策略。
【IPC分類】C12N15/53, C12P13/04, C12N15/10, C12N15/70
【公開(kāi)號(hào)】CN105238807
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510817220
【發(fā)明人】饒志明, 周俊平, 楊套偉, 張蔡喆, 戚云龍, 鄭俊賢, 張顯, 徐美娟
【申請(qǐng)人】江南大學(xué)
【公開(kāi)日】2016年1月13日
【申請(qǐng)日】2015年11月23日