一種Protein D與HER2融合蛋白及其制備方法和應用
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明設及生物學和醫(yī)學領域，具體地，本發(fā)明設及一種可制備肥R2/neu抗原陽 性腫瘤疫苗的融合蛋白，具體而言是一種包括流感嗜血桿菌（化emo地ilusinfluenzae， m)蛋白D(ProteinD，PD)與肥R2/neu腫瘤抗原的融合蛋白。
【背景技術】
[0002] 對于腫瘤的治療，目前有手術療法、化學療法、放射療法等。手術療法對于多組織 轉移的患者來說，沒有治療意義?；瘜W療法和放射療法由于特異性較差會對正常細胞造成 損害。因此臨床上需要一種特異性較強的藥物，特異性地殺傷腫瘤細胞而對正常細胞不 造成損害。腫瘤免疫療法是激活體內(nèi)針對腫瘤抗原的細胞毒性T淋己細泡（cytotoxicT lymphocytes,CTL)，通過被激活的CTL去殺傷表達相應腫瘤抗原的腫瘤細胞，因而具有特 異性。腫瘤特異抗原或相關抗原是研制具有特異性CTL激活作用的生物制品的關鍵。
[0003] 肥R2是一種腫瘤相關抗原，其編碼基因位于人第17對染色體長臂21位（17q21)， 編碼跨膜受體樣的憐酸化糖蛋白，分子量為185KD，故又被稱為P185。P185由1255個氨基 酸組成，其胞外段是由632個氨基酸組成的配體結合域，運個區(qū)域富含半脫氨酸；跨膜區(qū)是 由22個氨基酸組成的強疏水區(qū)，作為膜錯定區(qū)而使整個蛋白質(zhì)分子定位在細胞膜上；其胞 內(nèi)段由580個氨基酸構成，含酪氨酸激酶活性域（Coussens以1985)。
[0004] 通常情況下，肥R2基因主要是在人類的胚胎發(fā)育時期表達，參與多種組織器官 的生長發(fā)育。在人類成年后，只在一些特定組織中，如：腎臟、肝臟、乳腺組織、卵巢、膜臟、 胃等組織中存在低水平表達。在人類腫瘤中，由于基因產(chǎn)物的過度表達使肥R2/neu的分 子表達發(fā)生改變，在20%~30%的侵襲性乳腺癌患者中有肥R2的擴增。此外在卵巢癌 (17-37 % )，非小細胞肺癌（27-56 % )，間質(zhì)癌（37 % )，膀脫癌（36 % )，食道癌化0-73 % )， 唾液腺癌（32-62% )，原發(fā)性腎細胞癌（10% )，膜腺癌（> 50% )中都有其過表達（Slamon DJ，1989;SdineiderPM，1989;WeinerDB，1990;YokotaJ，1988;HouL，1992;Scheurle0， 2000;SeligerB，2000;LipponenP，1994;TagliabueE，2000)?？梢?，肥R2 的過表達在腫 瘤轉化中起積極作用，是腫瘤病因之一。此外，出現(xiàn)在乳腺癌發(fā)生早期階段的肥R2蛋白質(zhì) 的高表達，也增加腫瘤細胞的轉移能力，高表達的肥R2通過啟動多種轉移相關機制包括提 高：細胞遷移率、體外侵襲力、IV型膠原酶活性、影響某些粘附分子如上皮細胞巧粘蛋白等 的合成而促進轉移度lume-JensenP，2001)。因此，肥R2成為腫瘤治療疫苗的重要標祀之 〇
[0005]抗原的表位（epitope)又稱為抗原決定簇，determinant)，它是T細胞抗原受體（T cellreceptor,TCR)和B細胞抗原受體度cellreceptor,BCR)及抗體特異結合的基本 單位。根據(jù)與TCR和BCR結合的區(qū)別，表位可分為T細胞表位和B細胞表位。由于表位疫 苗缺乏Ξ維結構的分子小、免疫原性差、半衰期短，其不能單獨誘導免疫應答，即不具備免 疫原性，但當其與大分子蛋白質(zhì)或非抗原性的多聚賴氨酸等載體交聯(lián)或結合后可獲得免疫 原性，誘導免疫應答。
[0006] 流感嗜血桿菌PD蛋白是高度保守的表面脂蛋白，作為化的一種特征性毒力決定 因子，流感嗜血桿菌PD蛋白在化引起呼吸道感染過程中起重要作用。人們最初是在研究 化與人I曲骨髓瘤蛋白4490結合時確認流感嗜血桿菌PD蛋白的。對流感嗜血桿菌PD蛋 白編碼區(qū)DNA進行的序列分析顯示，流感嗜血桿菌PD蛋白的成熟蛋白有1092bp的開放讀 框編碼，由346個氨基酸組成，相對分子質(zhì)量42000。研究顯示，各化菌株中PD蛋白僅存在 很小的變異。核酸和氨基酸水平序列分析顯示，各菌株PD具有高度的保守性，并且基因置 換均勻分布于整個基因。分析分離于慢性支氣管炎患者不同感染期的化顯示，各菌株的流 感嗜血桿菌PD蛋白的基因僅發(fā)生很小的突變。采用3種不同的鼠抗PD單克隆抗體進行蛋 白印跡分析發(fā)現(xiàn)，PD蛋白存在于所有127株化中，每株細菌表面的PD分子數(shù)量約為2800 個。運些研究均證實，流感嗜血桿菌PD蛋白是位于菌體表面的外膜蛋白，具有高度的抗原 保守性，是極具潛力的疫苗候選蛋白。
[0007] 流感嗜血桿菌PD蛋白是一種具有甘油憐酸二醋酶活性的細菌毒力因子，能導致 宿主上皮細胞釋放憐酸膽堿。WPD蛋白作為載體蛋白的肺炎鏈球菌多糖結合疫苗，能預防 肺炎鏈球菌性耳炎。PD蛋白是迄今為止第一種能在人類機體中誘導保護性應答的不可分型 流感嗜血桿菌抗原，也是最具潛力的多糖結合疫苗候選載體蛋白。
[0008] 流感嗜血桿菌PD蛋白是新型的結合疫苗蛋白載體之一，2009年由葛蘭素史克公 司研發(fā)的十價肺炎結合疫苗Synflorix在歐洲上市，運個疫苗將1，5和7FΞ個血清型的肺 炎球菌芙膜多糖連接到流感嗜血桿菌PD蛋白上，臨床數(shù)據(jù)表明了其良好的免疫原性和安 全性。
[0009]引起急性中耳炎疾病的兩大病源菌是肺炎球菌和無芙膜流感嗜血桿菌，二者都被 認為是下呼吸道感染的主要因素。雖然肺炎球菌芙膜多糖的疫苗應用了很多年，但是對于 兒童的保護性很差。后來，一屯價肺炎多糖疫苗用CRMw作為載體的結合疫苗，能夠對兒童 起到保護作用，預防肺炎球菌引起的侵襲性疾病和急性中耳炎。而缺點是CRMw運個載體同 樣也用于了Hib和腦膜炎的結合疫苗，因此，同樣的載體可能就會對疫苗的免疫力產(chǎn)生負 面的影響?；赪上的原因和流感嗜血桿菌PD蛋白本身的優(yōu)點，比如說膜定位，序列保守， 分布廣泛，致病性和良好的臨床前實驗結果，都使得流感嗜血桿菌PD蛋白成為了肺炎十價 多糖疫苗的載體蛋白，并可W預防肺炎球菌和無芙膜化b的雙重感染。同時在本實驗室的 前期工作中W證明利用Hi蛋白作為載體佐劑蛋白，攜帶外源性表位在添加或者不添加佐 劑后能夠誘導動物產(chǎn)生良好的免疫應答。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0010] 本發(fā)明的目的是提供一種可用于制備HER2抗原陽性腫瘤治療性疫苗的融合蛋 白。
[0011] 腫瘤治療性疫苗設計初衷是打破由腫瘤細胞引起的機體免疫耐受，由于機體免疫 耐受的影響，使機體免疫系統(tǒng)不能識別非己成分，免疫系統(tǒng)無法識別腫瘤相關抗原，最終導 致免疫抑制。研究報道發(fā)現(xiàn)免疫全序列的肥R2蛋白并不能打破免疫耐受，激發(fā)免疫應答， 申請人在研究中發(fā)現(xiàn)由于全序列肥R2蛋白包含有造成免疫耐受的表位，因而，在腫瘤治 療性疫苗的設計中，選擇截取的部分序列代替全長序列更利于打破免疫耐受，如肥R2胞外 區(qū)、跨膜區(qū)、胞內(nèi)區(qū)或者一些Tcell表位和Bcell表位。
[0012] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供如下的技術方案：
[0013] 一種融合蛋白，所述融合蛋白由所述佐劑蛋白通過接頭化inker)或直接連接的 方式與腫瘤相關抗原的N端或C端連接形成；其中，
[0014] 所述佐劑蛋白包含流感嗜血桿菌化aemo地ilusinfluenzae,Hi)蛋白D或所述流 感嗜血桿菌蛋白D的片段；
[0015] 所述腫瘤相關抗原包含氨基酸序列為SEQIDNO:3的人肥R2蛋白質(zhì)或其片段；
[0016] 優(yōu)選地，所述腫瘤相關抗原由人肥R2抗原胞外區(qū)片段和肥R2表位膚片段組合形 成，所述肥R2抗原胞外區(qū)片段的氨基酸序列為SEQIDNO:4,所述肥R2表位膚片段的氨基 酸序列為SEQIDNO:5。
[0017] 優(yōu)選地，所述接頭的氨基酸序列為-GGGGSGGGGSGGGGS-;優(yōu)選地，所述佐劑蛋白通 過直接連接的方式與所述腫瘤相關抗原的N端連接。
[0018] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述融合蛋白的氨基酸序列為SEQIDNO:6。
[0019] 本發(fā)明還提供了一種表達載體，所述表達載體由編碼如權利要求1或2所述 的融合蛋白的核巧酸序列連接商業(yè)化載體W及任選地加入酶切識別位點序列和/或 編碼蛋白質(zhì)標簽的序列構建而成，所述商業(yè)化載體選自美國Merk公司祀T載體系統(tǒng) 如祀T-28a-c(+)、pET29a、祀T-30a-c(+)、祀T39b(+)、祀T-40b(+)、pET-41a(+)W及 祀Τ-43.la(+)中的一種或多種；優(yōu)選地，所述核巧酸序列為SEQIDN0:7。
[0020] 在根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案中，所述表達載