體還包含位于所述核巧酸序列5'端 的依次排列的酶切識別位點、組氨酸標簽和腸激酶位點對應的編碼核酸序列，優(yōu)選地，所述 依次排列的酶切識別位點、組氨酸標簽和腸激酶位點對應編碼核酸序列SEQIDNO:8。
[0021] 在根據(jù)本發(fā)明的一另一個實施方案中，所述表達載體還包含位于所述核巧酸序列 3'端的終止密碼子序列和酶切識別位點序列；優(yōu)選地，所述終止密碼子序列和酶切識別位 點序列為SEQIDNO:9;更優(yōu)選地，編碼所述融合蛋白的核巧酸序列為SEQIDNO:10。
[0022] 本發(fā)明還提供了一種含有上述表達載體的宿主細胞，所述宿主細胞為細菌或 真菌；優(yōu)選地，所述宿主細胞為大腸桿菌；更優(yōu)選地，所述大腸桿菌選自化21 0E3)、 化2UDE3)PlysS或TB1。
[0023] 本發(fā)明進一步提供了上述融合蛋白的制備方法，將上述的宿主細胞經(jīng)IPTG(Merk， 美國）誘導融合蛋白表達，收集包涵體，提取包涵體中的融合蛋白，純化得到融合蛋白；
[0024] 優(yōu)選地，所述純化是通過下述方法實現(xiàn)的：
[00巧]將融合蛋白通過馨合層析柱進行純化。
[0026] 在本發(fā)明的一個實施方案中，所述純化步驟還包括：
[0027]W腸激酶酶切融合蛋白，然后將酶切后的融合蛋白上樣于酶切目的蛋白上樣于 化2+-QielatingSe地aroseFastFlow，再?濃度為 50mM的咪挫洗脫。
[0028] 本發(fā)明提供的融合蛋白可用于制備肥R2抗原陽性腫瘤疫苗，所述疫苗包含如上 所述的融合蛋白；優(yōu)選地，所述疫苗為HER2抗原陽性腫瘤治療性疫苗；優(yōu)選地，所述抗原陽 性腫瘤為乳腺腫瘤。
[0029] 進一步地，所述疫苗還包含佐劑，所述佐劑選自GM-CSF和GM-CSF+CpG中的一種或 多種；優(yōu)選地，所述疫苗的劑型為注射劑。
[0030] 本發(fā)明ProteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗的制備方法及應用包括如下步驟：
[0031]W構建重組祀T-30a(+)原核表達載體為例：①構建祀T-30a(+)原核表達載體； ②含有編碼化的PD蛋白19-129aa核酸序列、肥R2蛋白41-560aa的核酸序列，肥R2蛋 白774-790aa的核酸序列，W及Linker的核酸序列的重組原核表達載體；③提供一種用于 表達的大腸桿菌，將含有編碼化的PD蛋白19-129aa核酸序列、肥R2蛋白41-560aa的核 酸序列，肥R2蛋白774-790aa的核酸序列，Linker的核酸序列的重組原核表達載體轉(zhuǎn)化用 于表達的大腸桿菌，經(jīng)轉(zhuǎn)化后可W穩(wěn)定表達ProteinD與肥R2融合蛋白；④提供用于純化 ProteinD與肥R2融合蛋白的方法。
[0032] 本發(fā)明產(chǎn)品及方法中所述的百分含量均為質(zhì)量體積百分含量。
[0033] 本發(fā)明設及一種ProteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗。該疫苗包含有PD蛋 白的19-129aa，肥R2蛋白的41-560aa，肥R2蛋白的774-790aa，可W激發(fā)良好的機體免疫 應答，打破免疫耐受。本發(fā)明制備的ProteinD與肥R2融合蛋白可在體外刺激巨隧細胞 大量分泌表達TNF-a。同時對本發(fā)明制備的ProteinD與肥R2融合蛋白進行了藥效實 驗，分別通過免疫注射經(jīng)此形成的融合蛋白治療性疫苗加入或不加入佐劑，可在50天內(nèi)抑 審IJ4T1-肥R2細胞在Ba化/c小鼠的乳腺癌動物模型增殖，腫瘤生長抑制率達到90 %W上， 由ProteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗激活的細胞免疫明顯高于PBS對照組。由此表 明研發(fā)的化oteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗在含有或不含有佐劑的情況下，對抑制 4T1-HER2細胞在Ba化/c小鼠乳腺癌動物模型增殖具有良好的免疫治療性作用。其中所述 4T1-肥R2細胞為攜帶人源肥R2的cDNA經(jīng)逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)染小鼠乳腺癌4T1細胞株構建而成 的；其中所述4T1-HER2乳腺癌動物模型為注射4T1-HER2到雌性BALB/C小鼠皮下建立的動 物模型。
[0034] 本發(fā)明的有益效果是：
[0035] 通過篩選抗原表位，并串聯(lián)表達，避開肥R2蛋白免疫耐受表位，打破腫瘤患者自 身的免疫耐受，激活機體抗腫瘤免疫。
[0036] 通過將抗原表位與PD蛋白偶聯(lián)表達，利用PD蛋白的高免疫原性作為佐劑蛋白制 備的重組蛋白，能夠提高重組蛋白免疫原性，促進抗原提呈，增強機體抗腫瘤免疫應答。
[0037] 本發(fā)明制備的重組蛋白，能夠抑制B1油/c小鼠體內(nèi)肥R2陽性乳腺癌細胞的增殖， 或者延緩乳腺腫瘤的增長速度。
[0038] 本發(fā)明制備的重組蛋白對人肥R2陽性乳腺癌術后防治復發(fā)，化療放療治療的輔 助治療具有很大應用前景，能夠激發(fā)機體免疫應答，利用自身免疫系統(tǒng)對癌細胞的殺傷。
[0039] 本發(fā)明制備的重組蛋白對人肥R2陽性腫瘤術后防治復發(fā)，化療放療治療的輔助 治療具有很大應用前景，能夠激發(fā)機體免疫應答，利用自身免疫系統(tǒng)對癌細胞的殺傷。
[0040] 本發(fā)明制備的ProteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗可不含有佐劑，也可W含有 如下佐劑中的一種或幾種：①GM-CSF;②CpG;③GM-CSF+CpG等。
[0041] 本發(fā)明制備的ProteinD與肥R2融合蛋白治療性疫苗可制成多種臨床適用的劑 型，包含但不限于注射劑型。
【附圖說明】
[0042] 圖1祀T30-a(+)-PD-HER2表達載體構建示意圖；
[0043]圖 2pET30-a(+)-PD-肥R2/BL21 (DE3)工程菌誘導表達SDS-PAGE電泳圖；
[0044] 圖3PD-肥R2融合蛋白疫苗體外細胞測活曲線；
[0045] 圖4PD-HER2融合蛋白疫苗小鼠體內(nèi)試驗腫瘤生長曲線；
[0046] 圖5PD-肥R2融合蛋白疫苗小鼠體內(nèi)試驗生存率曲線。
【具體實施方式】
[0047] 為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，W下結合附圖及實施例，對 本發(fā)明進一步詳細說明。應當理解，此處說描述的具體實施例僅用W解釋本發(fā)明，并不用于 限定本發(fā)明。
[0048]連施例1重組PD-HER2融合蛋白治療性疫苗工程菌構建
[0049] 1.pET30-a(+) -PD-肥R2/BL21 (DE3)工程菌構建
[0050] 選擇來源于化的PD蛋白（GenBank登錄號：CAA84716)，全長364個氨基酸，如SEQ IDNO:1所示。選取PD蛋白19-127位氨基酸作為佐劑蛋白，如SEQIDNO:2所示。腫瘤 相關抗原人肥R2 (GenBank登錄號：AAA75493. 1)全長1255個氨基酸，如SEQIDNO:3所 示。選取肥R2抗原胞外區(qū)片段（41-560aa)和肥R2表位膚片段（774-788aa)作為疫苗分 子抗原。肥R2抗原胞外區(qū)片段（41-560aa)氨基酸序列如SEQIDN0:4,肥R2表位膚片段 (774-788aa)如沈QIDNO:5 所示。
[0051] 重組PD-肥R2融合蛋白治療性疫苗分子為，將PD蛋白19-127位氨基酸通過 Linker序列-GGGGSGGGGSGGGGS-連接至肥R2抗原胞外區(qū)片段（4l-560aa)N端，再將肥R2表 位膚片段（774-788aa)直接連接于肥R2抗原胞外區(qū)片段（41-560aa)C端。設計的PD-肥R2 融合蛋白氨基酸序列如SEQIDNO:6所示，其對應編碼核酸序列如SEQIDNO:7所示。
[0052] 為了純化方便，在PD-肥R2融合蛋白核酸序列（SEQIDNO:7)5'端依次加上 6X化S標簽和腸激酶位點皿孤DK)對應編碼核酸序列，和Ndel識別位點，如SEQID NO:8CATATGCACCACCACCACCACCACGACGACGACGATAAA，其中下戈1|線化為Ndel識別位點，CACC ACCACCACCACCACGACGACGACGATAAA-為HHHHH皿孤DK對應的編碼核酸序列。同時在PD-肥R2 融合蛋白核酸序列（SEQIDNO:7) 3'端依次加上兩個終止密碼子序列和Notl識別序列， 如沈QIDNO:9TAATGAGCGGCCGC，下劃線為兩個終止密碼子序列，GCGGCCGC為Notl識別 序列。將該設計的PD-HER2融合蛋白核巧酸序列委托南京金斯瑞生物科技有限公司進行 全基因合成（核巧酸序列為SEQIDN0:10)。通過Ndel/Notl位點燈AKARA，大連）亞 克隆至表達載體，其載體選自商業(yè)化載體祀T-30a-c(+) (Merk，美國），構建獲得表達載體 祀T30-a(+)-PD-肥R2,構建示意