根據(jù)pYES2載體和△9FAD基因不含葉綠體轉(zhuǎn)運肽 的0RF序列設(shè)計引物Seq13和Seq14 (含EcoRI/Xbal酶切位點）進行PCR擴增，TA克隆 并經(jīng)EcoRI/Xbal雙酶切后，利用T4連接酶連接得到重組載體ρΥ- Δ 9FAD。
[0043] 5)將重組載體ρΥ-Δ9FAD在電穿孔儀中用電擊法轉(zhuǎn)化釀酒酵母油酸合成缺陷型 olel突變株BY4389(His-、Leu_及Ura-缺陷型，便于轉(zhuǎn)基因酵母篩選），運用含0. 005%亞 油酸（LA)的尿嘧啶缺陷合成培養(yǎng)基（SC-U)篩選得到轉(zhuǎn)基因酵母Y-A9FAD。
[0044] 6)將轉(zhuǎn)基因及轉(zhuǎn)空載質(zhì)粒的酵母接種于YH)培養(yǎng)基，添加適量LA，在2%葡萄糖 YH)培養(yǎng)基中28°C培養(yǎng)3d，達到一定生物量后轉(zhuǎn)到不含LA的YH)培養(yǎng)基中，添加2%的半 乳糖25°C條件下低轉(zhuǎn)速誘導(dǎo)3d。收集酵母，冷凍干燥。直接對酵母利用甲醇-硫酸方法進 行脂肪酸甲酯化。
[0045] 7)利用氣質(zhì)聯(lián)用（GC-MS)在轉(zhuǎn)缺刻緣綠藻A9FAD基因的酵母細胞中檢測到棕櫚 酸和硬脂酸的去飽和產(chǎn)物一一分別為棕櫚油酸和油酸，說明〇lel突變的酵母BY4389在轉(zhuǎn) 入該基因后，恢復(fù)棕櫚油酸和油酸的合成能力。從而證明該基因所編碼蛋白具有A9FAD的 功能。
[0046] 具體操作如下：
[0047] 1、材料
[0048] 1)缺刻緣綠藻（MyrmeciaincisaReisigl)H4301 購自Culturecollectionof algaeofCharlesUniversityofPrague(CAUP)。在溫度為 25°C、光照強度為 115ymol photonsm2s\光/暗比為14h/10h的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)基為BG-11。
[0049] 2)pYES2本實驗室保存，油酸合成缺陷型olel突變株酵母BY4389(His_、Leu-及 Ura_缺陷型）購自日本大阪大學(xué)。酵母在YH)培養(yǎng)基，于28°C下以200轉(zhuǎn)/min(rpm)轉(zhuǎn)速 振蕩培養(yǎng)。
[0050] 2、方法
[0051] 1)取100mg新鮮的藻細胞置于預(yù)冷的研缽中，加入液氮充分研磨。
[0052] 2)TRIzol(Invitrogen公司）法抽提總RNA，_2〇°C保存?zhèn)溆?。?_5 μgRNA用反 轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa公司）進行cDNA第一鏈合成，作為基因克隆的PCR反應(yīng)模板。利用植 物基因組DNA提取試劑盒（天根公司）提取DNA，作為擴增內(nèi)含子的PCR反應(yīng)模板。
[0053] 3)根據(jù)自缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量文庫中篩選到1條與已知物種Δ9FAD基因同 源的contig序列（Contigl6329)設(shè)計基因特異性引物（genespecificprimers，GSP)Seq 1(SEQIDΝ0· 1)和Seq2(SEQIDΝ0· 2)，按照SMART?RACEcDNA擴增試劑盒（Clontech 公司）的使用說明分別建立5' -RACE和3' -RACE反轉(zhuǎn)錄體系，然后應(yīng)用降落PCR原理進 行擴增。25yL的Y-RACE反應(yīng)體系包含：17yL的PCR級水、2.5yL的lOXAdvantage 2PCR緩沖液、0· 5yL的dNTP、0. 5yL引物（Seq1)、2· 5yL的 10XUPM、L5yL的 5'-RACE cDNA、0.5yL的50XAdvantage2聚合酶混合液。：V-端的反應(yīng)體系，除0.5yL的引物 (Seq2)和1. 5yL的:V-RACEcDNA外，其它的同Y-端反應(yīng)體系。反應(yīng)程序：94°C變性 3〇8,72°(：延伸15〇8,5個循環(huán)；94°(：變性3〇8,70°(：退火3〇8,72°(：延伸15〇8,5個循環(huán) ；941€ 變性30s，68°C退火30s，72°C延伸150s，30個循環(huán)；72°C延伸7min。隨后，對RACE產(chǎn)物進行 電泳（圖1)和膠回收，然后連接到PMD19-T載體（圖2)并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌（Escherichia coli)DH5α感受態(tài)細胞，進行藍白斑篩選，挑取陽性克隆，經(jīng)菌落PCR驗證后送往上海生工 生物工程公司測序。將測序得到的5' -和3' -RACE片段與已知片段的序列進行拼接，并重 新設(shè)計引物及測序驗證，得到了A9FAD基因的全長cDNA序列（Seq3，SEQIDN0. 3)。
[0054] 該序列全長2442bp，其中，5'-非翻譯區(qū)（UTR)和3'-UTR分別為157bp和986bp， 開讀閱讀框（〇RF)長為1299bp，編碼432個氨基酸殘基（Seq15,SEQIDNO. 15)。根據(jù) 全長cDNA序列設(shè)計四對基因特異引物Seq4(SEQIDNO. 4)和Seq5(SEQIDNO. 5)、Seq 6(SEQIDNO. 6)和Seq7(SEQIDNO. 7)、Seq8(SEQIDNO. 8)和Seq9(SEQIDNO. 9)及 Seq10(SEQIDNO. 10)和Seq11(SEQIDNO. 11)，分別進行內(nèi)含子擴增。反應(yīng)體系包括： 1.0yLDNA模板，引物各 0.5yL，10.5yL的無RNase水，12.5yL2XTaqPCRMasterMix。 PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，36個循環(huán)包含94°C變性lmin、68. 5°C退火lmin以及72°C 延伸3min;最后72°C延伸10min。PCR產(chǎn)物按上述方法經(jīng)膠回收、克隆、藍白斑篩選、菌落 PCR驗證和測序，并將測序結(jié)果與原0RF區(qū)拼接，得到Δ9FAD基因的DNA序列（Seq12,SEQ IDΝ0· 12)。
[0055] 利用Blastx搜索結(jié)果顯示缺刻緣綠藻A9FAD基因0RF區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)與萊 茵衣藻（Chlamydomonasreinhardtii)硬脂酰-ACP去飽和酶蛋白具有65%的相似度。 ChloroP1.1Server預(yù)測其N端具有61個氨基酸殘基組成的葉綠體轉(zhuǎn)運肽。在生物體內(nèi)， 轉(zhuǎn)運肽是把胞質(zhì)中合成的目標(biāo)蛋白運送到相應(yīng)細胞器的靶向蛋白，目標(biāo)蛋白在進入細胞器 時，該轉(zhuǎn)運肽就會被肽酶切除。因此在進行目的基因的功能鑒定時，應(yīng)排除轉(zhuǎn)運肽序列。
[0056] 4)根據(jù)pYES2載體和Δ9FAD基因不含葉綠體轉(zhuǎn)運肽的0RF序列（Seq3的第 341bp至第1 453bp)設(shè)計引物Seq13(SEQID勵.13，第]^卩至26卩為保護堿基，第36卩至 8bp為EcoRI酶切位點）和Seq14(SEQIDNO. 14,第lbp至2bp為保護堿基，第3bp至8bp 為Xbal酶切位點）。以缺刻緣綠藻的cDNA為模板進行PCR擴增。反應(yīng)體系如下：1. 0μL cDNA模板，引物Seq13 和Seq14 各 0· 5μL，10. 5μL的無RNase水，12. 5μL2XTaqPCR MasterMix。PCR反應(yīng)條件：95°C預(yù)變性5min，36個循環(huán)包含94°C變性lmin、68. 5°C退火 lmin以及72°C延伸90s，最后72°C延伸lOmin。PCR產(chǎn)物按上述方法經(jīng)膠回收、克隆、藍白斑 篩選、菌落PCR驗證和測序，以確保目的基因序列的準(zhǔn)確性。這樣就獲得了pMD19T-A9FAD 質(zhì)粒。
[0057] 5)將攜帶正確目的基因序列的大腸桿菌進行培養(yǎng)，然后抽提pMD19T-Δ9FAD質(zhì) 粒，用限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xbal進行雙酶切消化反應(yīng)。同時對提取的pYES2質(zhì)粒也進 行EcoRI和Xbal雙酶切反應(yīng)。反應(yīng)體系為2μL的10XM緩沖液，4μL的0. 1%BSA，DNA 2μg，EcoRI及Xbal各1μL，加無RNase水至20μL。37°C消化反應(yīng)4h。將酶切后的產(chǎn)物 進行電泳后割膠回收目的片段，并用T4DNA連接酶將酶切后的△ 9FAD基因片段與pYES2片 段連接得到重組載體pY-A9FAD。連接反應(yīng)體系為：2. 5μL的連接緩沖液，Δ9FAD基因DNA 約 0· 3pmol，載體pYES2 的DNA約 0· 03pmol，1μL的T4DNA連接酶，加無RNase水至 25μL， 16°C連接過夜。連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細胞，利用含50mg/L氨芐（Amp)的LB培 養(yǎng)基篩選，菌落PCR和測序以確保序列的準(zhǔn)確性。從大腸桿菌DH5a中抽提PY- △ 9FAD質(zhì) 粒，-20 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0058] 6)酵母感受態(tài)細胞制備。將酵母接種于含0. 005%LA的YH)培養(yǎng)基中，28°C復(fù)蘇 培養(yǎng)過夜，然后按1:100放大培養(yǎng)，以250rpm轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)至細胞密度約