為1X10s細(xì)胞/ mL(約4~5h)。冰上冷卻15min使細(xì)胞停止生長(zhǎng)，4°C條件下以5000rpm轉(zhuǎn)速離心5min收 集酵母細(xì)胞，預(yù)冷無菌水洗滌細(xì)胞2次，同樣條件下離心收集。20mL預(yù)冷的1M山梨醇洗滌 細(xì)胞1次，然后溶于〇. 5mL預(yù)冷的1M山梨醇，調(diào)整細(xì)胞的密度在1X101°細(xì)胞/mL。冰上保 存細(xì)胞（或是4°C)，便于電擊使用。
[0059] 7)利用電穿孔儀（Bio-Rad)將重組的載體ρΥ-Δ9FAD電擊轉(zhuǎn)化酵母BY4389感受 態(tài)細(xì)胞。取在冰上預(yù)冷的待轉(zhuǎn)化的pY-Δ9FAD重組質(zhì)粒DNA約5~10μL(5~200ng)與 感受態(tài)細(xì)胞混勻，并與〇. 2cm的電擊杯一起冰上預(yù)冷，然后將DNA-細(xì)胞混合液轉(zhuǎn)移到預(yù)冷 的電擊杯輕輕混勻，冰浴5min后，選擇程序Sc2電擊一次。移走電擊杯，立刻加入lmL預(yù)冷 的1M山梨醇，輕輕轉(zhuǎn)移到新的YH)培養(yǎng)基中，28 °C輕微振蕩5h。將菌液涂布于含有0. 005% LA及1M山梨醇的尿嘧啶缺陷合成培養(yǎng)基（SC-U)上，28°C倒置靜置培養(yǎng)48-72h，挑取菌落 于含0. 005 %LA的液體SC-U培養(yǎng)基中培養(yǎng)。菌落PCR驗(yàn)證插入目的片段的序列后，用含 2%葡萄糖或2%棉籽糖的SC-U培養(yǎng)基保存菌種。
[0060] 10)將保存的菌液接種YPD培養(yǎng)基中，添加適量LA，28°C下以220rpm轉(zhuǎn)速振蕩培 養(yǎng)。然后離心收集并洗滌菌體，轉(zhuǎn)移到不含LA的2%半乳糖YH)培養(yǎng)基中，25°C下以150rpm 轉(zhuǎn)速振蕩培養(yǎng)72h。離心收集酵母菌體，經(jīng)去離子水洗滌3次后液氮凍存。
[0061] 11)將液氮凍存的酵母冷凍干燥，然后進(jìn)行脂肪酸甲酯化。稱取約25mg酵母粉末 于酯化瓶中，加入lmL含4%硫酸的甲醇溶液。充氮?dú)夂?，?5°C水浴鍋酯化反應(yīng)lh，便于 將結(jié)合的脂肪酸分子充分解離并甲基化。酯化反應(yīng)后，向上述酯化瓶中分別加入lmL去離 子水和lmL正己烷，充分混勻，然后在5500rpm下離心lOmin。收集上清液至樣品瓶中，氮?dú)?濃縮，4 °C保存?zhèn)溆谩?br>[0062] 12)采用Angilent7890B型氣相色譜儀進(jìn)行脂肪酸組成分析，色譜柱為HP-88型 毛細(xì)管柱（30mX0. 25mm);升溫程序?yàn)?0°C保留lmin，然后10°C/min升溫至230°C，最后 保留9min;不分流，氮?dú)狻錃?、空氣的流速分別為25mL/min、35mL/min、400mL/min。進(jìn)樣量 為 0· 2μL。
[0063] 13)GC_MS檢測(cè)新生成的產(chǎn)物。在轉(zhuǎn)基因的酵母中對(duì)照脂肪酸標(biāo)準(zhǔn)品及缺陷型 酵母確認(rèn)有新產(chǎn)物生成時(shí)，采用GC-MS檢測(cè)。GC的色譜柱為HP-INNOWaxPolyethylene Glyco(30mX320ymX0. 25μπι)連接MS四級(jí)桿，150C(最大值200C)。升溫程序50°C保持 lmin，以10°C/min升到150°C保持lmin，然后再以4°C/min升到230°C保持5min，運(yùn)行時(shí)間 37min。氦為載氣體，初始值50°C，壓力7. 6522psi，流速2. 6891mL/min，平均速率59. 763cm/ s，滯留時(shí)間0. 83664min，流速2. 6891mL/min，運(yùn)行時(shí)間37min。MS采集參數(shù)選用EMV模式， 跟蹤檢測(cè)的離子能為69. 922eV。
[0064] 3、結(jié)果
[0065] 1)利用RACE方法擴(kuò)增得到缺刻緣綠藻Δ9FAD基因的cDNA全長(zhǎng)序列（Seq3,SEQ IDNO. 3)。該序列全長(zhǎng) 2 442bp，其中，5'-UTR和 3'-UTR分別為 157bp和 986bp，0RF長(zhǎng) 為1299bp，編碼432個(gè)氨基酸殘基（Seq15，SEQIDNO. 15)。以DNA為模板，擴(kuò)增出了缺 刻緣綠藻A9FAD基因的DNA序列（Seq12,SEQIDN0. 12)。該序列全長(zhǎng)4 198bp，存在8 個(gè)內(nèi)含子，它們自5' -端開始依次位于該基因DNA序列的152-578、852-1025、1182-1460、 1625-1850、1939-2081、2178-2350、2503-2659 和 2823-3029 處，從而將該基因的cDNA序列 分成8個(gè)外顯子，并將5' -UTR分成長(zhǎng)分別為151bp和6bp的兩段（圖1中B)。
[0066] 2)選用pYES2載體通過限制性內(nèi)切酶EcoRI和Xbal成功地構(gòu)建了缺刻緣綠藻 Δ9FAD基因的表達(dá)載體ρΥ-Δ9FAD。因Δ9FAD基因序列位于pYES2載體的GAL1啟動(dòng)子下 游，可利用半乳糖誘導(dǎo)基因表達(dá)。
[0067] 3)采用電穿孔儀的電擊方法成功地將重組的表達(dá)載體ρΥ-Δ9FAD轉(zhuǎn)化到酵母 ΒΥ4389中。油酸合成缺陷型olel突變株酵母ΒΥ4389也是His'Leu'Ura-營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌 株，在轉(zhuǎn)入ρΥ-Δ9FAD質(zhì)粒后，因pYES2載體攜帶編碼尿嘧啶的URA3基因，轉(zhuǎn)基因酵母因而 能夠在尿嘧啶缺陷的合成培養(yǎng)基（SC-U)上生長(zhǎng)以便于篩選。
[0068] 4)轉(zhuǎn)基因酵母經(jīng)半乳糖誘導(dǎo)培養(yǎng)后，GC-MS檢測(cè)酵母甲酯化的脂肪酸。結(jié)果（圖 4)顯示A9FAD基因所編碼蛋白能在酵母中分別將棕櫚酸和硬脂酸去飽和為棕櫚油酸和油 酸。質(zhì)譜（圖4中Β和C)結(jié)果顯示，棕櫚油酸和油酸上的不飽和鍵都位于△ 9碳位置上。 表明自缺刻緣綠藻中所克隆到的該基因所編碼的蛋白質(zhì)具有A9脂肪酸去飽和酶的功能。
[0069] 以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，應(yīng)當(dāng)指出，對(duì)于本技術(shù)領(lǐng)域的普通技術(shù)人 員，在不脫離本發(fā)明方法的前提下，還可以做出若干改進(jìn)和補(bǔ)充，這些改進(jìn)和補(bǔ)充也應(yīng)視為 本發(fā)明的保護(hù)范圍。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種多肽，其特征在于，所述的多肽的氨基酸序列如SEQIDNO. 15的第62-432位或 SEQIDNO. 15 所示。2. -種分離的核苷酸序列，其特征在于，所述的核苷酸序列包括： a)SEQIDNO. 3 的第 341bp至第 1 453bp、SEQIDNO. 3 的第 158bp至第 1 453bp、SEQ IDNO. 3或SEQIDNO. 12所示的核苷酸序列；或 b) 與a)所示的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。3. -種重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的重組表達(dá)載體是由權(quán)利要求2所述的核苷 酸序列與質(zhì)粒或病毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的重組表達(dá)載體，其特征在于，所述的質(zhì)粒是pYES2質(zhì)粒。5. -種基因工程化的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞選自于下列中的一種： a) 用權(quán)利要求2所述的核苷酸序列轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞； b) 用權(quán)利要求3或4所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞。6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì) 胞、植物細(xì)胞或動(dòng)物細(xì)胞。7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是酵母細(xì)胞。8. 權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2所述的核苷酸序列、權(quán)利要求3或4所述的重組 表達(dá)載體、或權(quán)利要求5-7任一所述的宿主細(xì)胞在合成多不飽和脂肪酸中的用途。9. 權(quán)利要求1所述的多肽、權(quán)利要求2所述的核苷酸序列、權(quán)利要求3或4所述的重組 表達(dá)載體、或權(quán)利要求5-7任一所述的宿主細(xì)胞在將棕櫚酸去飽和為棕櫚油酸或?qū)⒂仓?去飽和為油酸中的用途。
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種編碼缺刻緣綠藻Δ9脂肪酸去飽和酶的DNA序列及其應(yīng)用。通過對(duì)缺刻緣綠藻轉(zhuǎn)錄組高通量數(shù)據(jù)庫的篩選，獲得1條與已知物種Δ9FAD基因同源的contig序列，并由此設(shè)計(jì)引物，利用cDNA末端快速擴(kuò)增技術(shù)克隆獲得缺刻緣綠藻Δ9FAD基因的全長(zhǎng)序列，在油酸合成缺陷型ole1突變株的釀酒酵母中異源表達(dá)該基因去葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽的ORF，對(duì)轉(zhuǎn)基因酵母的脂肪酸進(jìn)行GC-MS分析，在該轉(zhuǎn)基因突變株酵母中檢測(cè)到新產(chǎn)生的物質(zhì)—棕櫚油酸和油酸，從而證明該基因所編碼的蛋白具有Δ9FAD的功能。本發(fā)明為在植物體中進(jìn)行遺傳操作，以實(shí)現(xiàn)PUFA的高效合成創(chuàng)造了條件。
【IPC分類】C12N1/19, C12N15/63, C12P7/64, C12N5/10, C12N9/02, C12N1/21, C12N15/53, C12N1/15
【公開號(hào)】CN105274068
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510812047
【發(fā)明人】周志剛, 薛文斌, 劉凡
【申請(qǐng)人】上海海洋大學(xué)
【公開日】2016年1月27日
【申請(qǐng)日】2015年11月20日