用于檢測和治療多發(fā)性骨髓瘤的方法
【專利說明】用于檢測和治療多發(fā)性骨髓瘤的方法 相關(guān)申請的交叉引用 本申請要求2013年3月14日提交的美國臨時專利申請No. 61/785, 269和2013年3 月15日提交的美國臨時專利申請No. 61/790, 072的優(yōu)先權(quán)，各自的公開內(nèi)容均通過提述以 其全文并入本文。 發(fā)明領(lǐng)域 本發(fā)明提供了用于檢測和治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方法部分地基于表達于分離 自診斷為患有或被認為患有多發(fā)性骨髓瘤的個體的漿細胞中的非編碼線粒體RNA的表達 和亞細胞定位。 發(fā)明背景 多發(fā)性骨髓瘤是一種腫瘤疾病，其特征是骨骼和骨髓被形成多個腫瘤塊的骨髓瘤細胞 浸潤，所述多個腫瘤塊導(dǎo)致病理性骨折。該病情往往是進展性的和致命的。癥狀包括貧血、 腎損傷和血液中的球蛋白高水平以及對細菌感染的易感性增加。在多發(fā)性骨髓瘤中觀察 到的受損的異常免疫球蛋白產(chǎn)生可能是由于存在對正常B淋巴細胞成熟為抗體分泌細胞 進行抑制的單核細胞或巨噬細胞所致。預(yù)期壽命與該疾病診斷時的程度和對治療的響應(yīng)有 關(guān)。有響應(yīng)的患者的中位預(yù)期壽命為兩年。血清或尿中的高骨髓瘤蛋白水平、骨病損、高血 鈣、全血細胞減少、以及腎衰竭是不利征象。 雖然多發(fā)性骨髓瘤仍然是不能治愈的，但是近年來新療法的開發(fā)已大幅提高了響應(yīng)率 和生存率。盡管我們在這種復(fù)雜疾病的了解上有重大進展，在大多數(shù)治療中心中對處于相 似年齡階層和體能狀態(tài)的患者仍采取了標(biāo)準(zhǔn)的緩解-誘導(dǎo)治療方法。高劑量化學(xué)療法聯(lián)合 自體干細胞移植對于較年輕的患者而言仍然是標(biāo)準(zhǔn)療法。 意義未明的單克隆丙種球蛋白?。∕GUS)和多發(fā)性骨髓瘤是單克隆免疫球蛋白病的最 常見形式。意義未明的單克隆丙種球蛋白病是最普遍的漿細胞惡液質(zhì)，在超過75歲以上的 人群中發(fā)病率高達10%。意義未明的單克隆丙種球蛋白病和多發(fā)性骨髓瘤的分子基礎(chǔ)尚 未充分了解，因此不易將這兩種病癥進行區(qū)分。利用基于諸如骨髓漿細胞增多的量、尿或血 清中的單克隆免疫球蛋白的濃度、以及骨病損的存在的臨床標(biāo)準(zhǔn)的組合的分類系統(tǒng)，在2/3 的病例中多發(fā)性骨髓瘤或意義未明的單克隆丙種球蛋白病的診斷是相同的。尤其是在多發(fā) 性骨髓瘤的早期階段，鑒別診斷與一定程度的不確定性相關(guān)。 而且，在多發(fā)性骨髓瘤的診斷中，臨床醫(yī)師必須排除其中可能發(fā)生漿細胞反應(yīng)的其他 病癥（如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和結(jié)締組織病癥）、或轉(zhuǎn)移性癌（其中患者可能具有與骨轉(zhuǎn)移相關(guān) 的溶骨性病損）。因此，鑒于多發(fā)性骨髓瘤被認為具有延長的潛伏期并且在患上該惡性腫瘤 之后許多年才識別其臨床特征，在多發(fā)性骨髓瘤的疾病篩查和提供鑒別診斷方面需要新的 分子診斷技術(shù)。因此，需要用于鑒別診斷和識別多發(fā)性骨髓瘤的不同的和預(yù)后相關(guān)的臨床 亞組的新的準(zhǔn)確方法。 使得尋找這樣的新方法變得復(fù)雜的事實是，多發(fā)性骨髓瘤細胞固有多種抗凋亡信號傳 輸機制，導(dǎo)致它們對當(dāng)前化學(xué)療法有抗性且進而造成大多數(shù)患者最終致死的結(jié)局。雖然通 過間期熒光原位雜交（FISH)和DNA流式細胞術(shù)在>90 %的病例中觀察到非整倍性，在這種 典型低增生性腫瘤中的細胞遺傳學(xué)異常僅僅對約30%的病例提供有用信息并且通常是復(fù) 雜的，這些異常涉及平均七條不同的染色體。因此難于建立遺傳異常與臨床結(jié)局之間的關(guān) 聯(lián)。 因而，考慮到在多發(fā)性骨髓瘤腫瘤細胞內(nèi)的個體基因表達的不可靠性，存在對生物標(biāo) 記物的需要，所述生物標(biāo)記物的測定不僅能夠預(yù)測個體患有多發(fā)性骨髓瘤以及可能從抗癌 療法獲益的可能性，而且還可用于確定個體或個體的亞群是否很可能遭受復(fù)發(fā)，所述個體 或個體的亞群在針對多發(fā)性骨髓瘤的成功的抗癌治療之后正處于緩解中。這種標(biāo)記物有助 于對治療罹患或被認為患有多發(fā)性骨髓瘤的個體中有關(guān)的醫(yī)療保健專業(yè)人員進行指導(dǎo)。因 而，這種標(biāo)記物不僅用于診斷目的，還用于在治療開始和緩解建立之后對預(yù)后進行追蹤。 本發(fā)明提供了這樣一種生物標(biāo)記物，并且使用在分離自骨髓的漿細胞內(nèi)的非編碼線粒 體RNA(ncmtRNAs)的表達和亞細胞定位來選擇那些會受益于抗多發(fā)性骨髓瘤治療的個體 或個體亞群，以及鑒定在緩解之后很可能復(fù)發(fā)或已經(jīng)復(fù)發(fā)的個體。 貫穿本說明書，引用了不同的專利、專利申請和其他類型的出版物（例如，雜志文章）。 在此引證的所有專利、專利申請和出版物的披露內(nèi)容，都出于所有目的通過提述以其全文 并入本文。 發(fā)明概述 在本文中提供的本發(fā)明具體公開了使用非編碼線粒體RNA(ncmtRNAs)的表達和亞細 胞定位來選擇那些會受益于抗癌療法的疑似患有或正在患上多發(fā)性骨髓瘤的個體或個體 亞群的方法以及利用分離自個體骨髓的漿細胞中的ncmtRNA表達水平來指導(dǎo)患有或疑似 正在患上多發(fā)性骨髓瘤的個體的治療的方法。 因此，在一方面，本文提供了用于在對其有需要的個體中治療多發(fā)性骨髓瘤的方法，所 述方法包括：測量分離自個體骨髓的漿細胞中的正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)和反義 非編碼線粒體RNA(ASncmtRNA)的表達，其中SncmtRNA和ASncmtRNA兩者均表達指示該個 體未患多發(fā)性骨髓瘤，而其中SncmtRNA表達且ASncmtRNA缺乏表達則指示該個體患有多 發(fā)性骨髓瘤；并且，如果該個體的漿細胞僅僅表達SncmtRNA而不表達ASncmtRNA，則用一 種或多種抗癌治療劑治療該個體。在另一方面，本文提供了用于在對其有需要的個體中治 療多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方法包括：用一種或多種抗癌治療劑治療該個體，其中在治 療之前已經(jīng)確定，分離自該個體的骨髓的漿細胞表達正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)而 不表達反義非編碼線粒體RNA(ASncmtRNA)。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案 中，抗癌治療劑包括與人非編碼線粒體嵌合RNA分子充分互補的一種或多種寡核苷酸，所 述人非編碼線粒體嵌合RNA分子包括：(a)以其5'端共價連接至具有反向重復(fù)序列的多 核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖體RNA或（b)以其5'端共價連接至具有反向重復(fù) 序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA，其中這些寡核苷酸能夠與線粒體 嵌合RNA分子雜交而形成穩(wěn)定雙鏈體。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，其 中這些抗癌治療劑包括瑞米凱德（remicade)、多西他賽（docetaxel)、塞來昔布、美法侖、 地塞米松([)ecadron_?)、留類、吉西他濱、順鉬、替莫唑胺、依托泊苷、環(huán)磷酰胺、替莫唑胺 (temodar)、卡鉬、甲基節(jié)肼（procarbazine)、格立得（gliadel)、他莫昔芬、托泊替康、甲氨 蝶呤、為泰素（taxol)、泰索帝（taxotere)、氟尿啼啶、甲酰四氫葉酸、伊立替康、希 羅達、CPT-11、干擾素α、聚乙二醇干擾素α(例如PEG INTRON-A)、卡培他濱、順鉑、塞替 派、氟達拉濱、卡鉬、脂質(zhì)體柔紅霉素、阿糖胞苷、doxetaxol、pacilitaxel、長春堿、IL-2、 GM-CSF、達卡巴嗪、長春瑞濱、唑來膦酸、palmitronate、克拉霉素制劑（biaxin)、白消安、 潑尼松、硼替佐米(Velcade?)、二磷酸鹽、三氧化二砷、長春新堿、多柔比星(Doxil?)、 帕利他賽（paclitaxel)、更昔洛韋、阿霉素、雌莫司汀磷酸鈉（estrainustinesodium phosphate) (Emcyt1?)、舒林酸、和依托泊苷。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案 中，多發(fā)性骨髓瘤在用硼替佐米(Velcade?)、環(huán)磷酰胺、地塞米松、多柔比星、干擾素α、來 那度胺、美法侖、聚乙二醇干擾素α、潑尼松、沙利度胺（thalidomide)、和長春新堿中的一 種或多種治療之后復(fù)發(fā)。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，所述抗癌療法作 為治療患者中的挽救治療的一部分而施用，在所述患者中多發(fā)性骨髓瘤對于其他藥物而言 已成為難治性的。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，該方法進一步包括施用 一種或多種額外的療法。在一些實施方案中，該一種或多種額外的治療包括異體干細胞移 植療法。在一些實施方案中，該一種或多種額外的治療包括自體干細胞移植療法。在一些 實施方案中，在移植到罹病個體中之前用有效量的一種或多種寡核苷酸處理在自體干細胞 移植中使用的造血干細胞和/或骨髓，所述寡核苷酸與ASncmtRNA或SncmtRNA分子充分互 補而形成穩(wěn)定的雙鏈體。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，所述ASncmtRNA 包括人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以其5'端共價連接至具有 反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖體RNA。在一些實施方案中，該 ASncmtRNA包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、 和SEQIDNO:6。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，其中所述SncmtRNA包含 人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以其5'端共價連接至具有反向重 復(fù)序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA。在一些實施方案中，該SncmtRNA 包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、和SEQID NO: 3。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，通過RT-PCR或另一種基于PCR的方 法、Northern印跡法、原位雜交、或SAGE來測量SncmtRNA或ASncmtRNA的表達。在一些實 施方案中，通過定量RT-PCR(qRT-PCR)測量SncmtRNA或ASncmtRNA。在一些實施方案中，通 過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中， 通過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA的亞細胞定位。 在其他方面，本文提供了用于在對其有需要的個體中預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)的方法， 所述方法包括：(a)測量分離自個體骨髓的漿細胞中的正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA) 的亞細胞定位，其中SncmtRNA的細胞質(zhì)定位指示該個體處于緩解中；和（b)如果SncmtRNA 定位在漿細胞的細胞質(zhì)中，則用一種或多種維持抗癌治療劑治療該個體。在另一方面，本文 提供了用于在對其有需要的個體中預(yù)防多發(fā)性骨髓瘤復(fù)發(fā)的方法，所述方法包括：用一種 或多種維持抗癌治療劑治療該個體，其中在治療之前已經(jīng)確定，分離自該個體的骨髓的漿 細胞展現(xiàn)出正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)的亞細胞胞質(zhì)定位。在本文提供的任何實施 方案的一些實施方案中，這些抗癌治療劑包括與人非編碼線粒體嵌合RNA分子充分互補的 一種或多種寡核苷酸，所述人非編碼線粒體嵌合RNA分子包括：(a)以其5'端共價連接至 具有反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖體RNA或（b)以其5'端共價 連接至具有反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA，其中所述寡核 苷酸能夠與線粒體嵌合RNA分子雜交而形成穩(wěn)定雙鏈體。在本文提供的任何實施方案的一 些實施方案中，其中所述抗癌治療劑包括瑞米凱德、多西他賽、塞來昔布、美法侖、地塞米松 (Decadron?)、留類、吉西他濱、順鉑、替莫唑胺、依托泊苷、環(huán)磷酰胺、替莫唑胺、卡鉑、甲基 芐肼、格立得、他莫昔芬、托泊替康、甲氨蝶呤、Arisa?、泰素、泰索帝、氟尿嘧啶、甲酰四氫 葉酸、伊立替康、希羅達、CPT-11、干擾素α、聚乙二醇干擾素α(例如PEGINTR0N-A)、卡培 他濱、順鉬、塞替派、氟達拉濱、卡鉬、脂質(zhì)體柔紅霉素、阿糖胞苷、doxetaxol、paci1itaxel、 長春堿、IL-2、GM-CSF、達卡巴嗪、長春瑞濱、唑來膦酸、palmitronate、克拉霉素制劑、白消 安、潑尼松、硼替佐米yelcade?)、二磷酸鹽、三氧化二砷、長春新堿、多柔比星(Etoxi膽)、 帕利他賽、更昔洛韋、阿霉素、雌莫司汀磷酸鈉(Emcyt@)、舒林酸、和依托泊苷。在本文提 供的任何實施方案的一些實施方案中，多發(fā)性骨髓瘤在用硼替佐米(Vblcade?；!、環(huán)磷酰 胺、地塞米松、多柔比星、干擾素α、來那度胺、美法侖、聚乙二醇干擾素α、潑尼松、沙利度 胺、和長春新堿中的一種或多種治療之后復(fù)發(fā)。在本文提供的任何實施方案的一些實施 方案中，所述抗癌療法作為治療患者中的挽救治療的一部分而施用，在所述患者中多發(fā)性 骨髓瘤對于其他藥物而言已成為難治性的。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案 中，該方法進一步包括施用一種或多種額外的療法。在一些實施方案中，所述一種或多種 額外的療法包括異體干細胞移植療法。在一些實施方案中，所述一種或多種額外的療法 包括自體干細胞移植療法。在一些實施方案中，在移植到罹病個體中之前用有效量的一種 或多種寡核苷酸處理在自體干細胞移植中使用的造血干細胞和/或骨髓，所述寡核苷酸與 ASncmtRNA或SncmtRNA分子充分互補而形成穩(wěn)定的雙鏈體。在本文提供的任何實施方案 的一些實施方案中，所述ASncmtRNA包括人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分 子包含以其5'端共價連接至具有反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖 體RNA。在一些實施方案中，所述ASncmtRNA包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列 選自SEQIDN0:4、SEQIDN0:5、和SEQIDN0:6。在本文提供的任何實施方案的一些實 施方案中，所述SncmtRNA包含人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以 其5'端共價連接至具有反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA。 在一些實施方案中，該SncmtRNA包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQID N0:1、SEQIDN0:2、和SEQIDN0:3。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，通過 RT-PCR或另一種基于PCR的方法、Northern印跡法、原位雜交、或SAGE來測量SncmtRNA 或ASncmtRNA的表達。在一些實施方案中，通過定量RT-PCR(qRT-PCR)測量SncmtRNA或 ASncmtRNA。在一些實施方案中，通過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA。在本文提供 的任何實施方案的一些實施方案中，通過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA的亞細胞定 位。 在另一些方面，本文提供了用于在其個體中治療復(fù)發(fā)的多發(fā)性骨髓瘤的方法，所述方 法包括：(a)測量分離自所述個體骨髓的漿細胞中的正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)的 亞細胞定位，其中SncmtRNA的（i)細胞核或（ii)細胞質(zhì)和細胞核定位指示該個體已經(jīng)復(fù) 發(fā)；和（b)如果SncmtRNA定位在漿細胞的⑴細胞核或（ii)細胞質(zhì)和細胞核中，則用一 種或多種抗癌治療劑治療該個體。在另一方面，本文提供了用于在個體中治療復(fù)發(fā)的多發(fā) 性骨髓瘤的方法，所述方法包括：用一種或多種抗癌治療劑治療所述個體，其中在治療之前 已經(jīng)確定，分離自該個體的骨髓的漿細胞展現(xiàn)出正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)的（i) 細胞核或（ii)細胞質(zhì)和細胞核亞細胞定位。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案 中，這些抗癌治療劑包括與人非編碼線粒體嵌合RNA分子充分互補的一種或多種寡核苷 酸，所述人非編碼線粒體嵌合RNA分子包括：(a)以其5'端共價連接至具有反向重復(fù)序列 的多核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖體RNA或（b)以其5'端共價連接至具有反向重 復(fù)序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA，其中這些寡核苷酸能夠與線粒體 嵌合RNA分子雜交而形成穩(wěn)定雙鏈體。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，其 中這些抗癌治療劑包括瑞米凱德、多西他賽、塞來昔布、美法侖、地塞米松(Decadron?)、甾 類、吉西他濱、順鉑、替莫唑胺、依托泊苷、環(huán)磷酰胺、替莫唑胺、卡鉑、甲基芐肼、格立得、他 莫昔芬、托泊替康、甲氨蝶呤、Arisa?,泰素、泰索帝、氟尿嘧啶、甲酰四氫葉酸、伊立替康、 希羅達、CPT-11、干擾素α、聚乙二醇干擾素α(例如PEGINTR0N-A)、卡培他濱、順鉬、塞 替派、氟達拉濱、卡鉬、脂質(zhì)體柔紅霉素、阿糖胞苷、doxetaxol、pacilitaxel、長春堿、IL-2、 GM-CSF、達卡巴嗪、長春瑞濱、唑來膦酸、palmitronate、克拉霉素制劑、白消安、潑尼松、硼 替佐米(Velcade?)、二磷酸鹽、三氧化二砷、長春新堿、多柔比星(Doxil?)、帕利他賽、更 昔洛韋、阿霉素、雌莫司汀磷酸鈉(Emcyt?)、舒林酸、和依托泊苷。在本文提供的任何實 施方案的一些實施方案中，多發(fā)性骨髓瘤在用硼替佐米(Velcade?)、環(huán)磷酰胺、地塞米松、 多柔比星、干擾素α、來那度胺、美法侖、聚乙二醇干擾素α、潑尼松、沙利度胺、和長春新 堿中的一種或多種治療之后復(fù)發(fā)。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，所述抗 癌療法作為治療患者中的挽救治療的一部分而施用，在所述患者中多發(fā)性骨髓瘤對于其他 藥物而言已成為難治性的。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，該方法進一步 包括施用一種或多種額外的療法。在一些實施方案中，所述一種或多種額外的療法包括異 體干細胞移植療法。在一些實施方案中，該一種或多種額外的療法包括自體干細胞移植療 法。在一些實施方案中，在移植到罹病個體中之前用有效量的一種或多種寡核苷酸處理在 自體干細胞移植中使用的造血干細胞和/或骨髓，所述寡核苷酸與ASncmtRNA或SncmtRNA 分子充分互補而形成穩(wěn)定的雙鏈體。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，所述 ASncmtRNA包括人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以其5'端共價連 接至具有反向重復(fù)序列的多核苷酸的3'端的反義16S線粒體核糖體RNA。在一些實施方案 中，該ASncmtRNA包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:4、SEQID NO: 5、和SEQIDNO: 6。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，所述SncmtRNA包含 人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以其5'端共價連接至具有反向重 復(fù)序列的多核苷酸的3'端的正義16S線粒體核糖體RNA。在一些實施方案中，該SncmtRNA 包含一個或多個核苷酸序列，所述核苷酸序列選自SEQIDN0:1、SEQIDN0:2、和SEQID NO: 3。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中，通過RT-PCR或另一種基于PCR的方 法、Northern印跡法、原位雜交、或SAGE來測量SncmtRNA或ASncmtRNA的表達。在一些實 施方案中，通過定量RT-PCR(qRT-PCR)測量SncmtRNA或ASncmtRNA。在一些實施方案中，通 過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA。在本文提供的任何實施方案的一些實施方案中， 通過原位雜交測量SncmtRNA或ASncmtRNA的亞細胞定位。 在其他方面，本文提供了用于評估在疑似患有或正在患上多發(fā)性骨髓瘤的個體中針對 抗多發(fā)性骨髓瘤治療的有益響應(yīng)的可能性的方法，該方法包括：測量分離自個體骨髓的漿 細胞中的正義非編碼線粒體RNA(SncmtRNA)的亞細胞定位，其中SncmtRNA的細胞質(zhì)亞細胞 定位指示針對抗多發(fā)性骨髓瘤治療的有益響應(yīng)。在本文提供的任何實施方案的一些實施方 案中，所述SncmtRNA包含人線粒體嵌合RNA分子，所述人線粒體嵌合RNA分子包含以其5' 端共價