基于納米孔的通過(guò)混合的fret檢測(cè)的核酸分析的制作方法
【專利說(shuō)明】基于納米孔的通過(guò)混合的FRET檢測(cè)的核酸分析
[0001] 相關(guān)申請(qǐng)的交叉引用
[0002] 本申請(qǐng)要求2013年5月24日遞交的美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)?zhí)?1/827, 519的優(yōu)先權(quán) 的權(quán)益，其內(nèi)容以其整體被并入本文。
[0003] 背景
[0004] 在過(guò)去十年間開(kāi)發(fā)的DNA測(cè)序技術(shù)已經(jīng)徹底改革了生物科學(xué)，例如Lerner等 人，TheAuk, 127:4-15(2010) ;Metzker，NatureReviewGenetics, 11:31-46(2010);Holt 等人，GenomeResearch, 18:839-846(2008);并且具有徹底改革醫(yī)療實(shí)踐的許多方面的 可能性，例如，Voelkerding等人，ClinicalChemistry, 55:641-658 (2009);Anderson等 人，Genes, 1:38-69 (2010);Freeman等人，GenomeResearch，19:1817-1824(2009);Tucker 等人，Am.J.HumanGenet.，85:142-154(2009)。然而，要實(shí)現(xiàn)這種可能性，仍然存在許多 必須解決的挑戰(zhàn)，包括減少每次運(yùn)行測(cè)序的成本、簡(jiǎn)化樣品制備、減少運(yùn)行時(shí)間、增加讀段 (read)長(zhǎng)度、改善數(shù)據(jù)分析等等，例如，Baker,NatureMethods, 7:495-498 (2010);Kircher 等人，Bioessays, 32:524-536 (2010);Turner等人，AnnualReviewofGenomicsand HumanGenetics, 10:263-284(2009)。利用納米孔的單分子測(cè)序可以解決這些挑戰(zhàn)中的一 些，例如，Maitra等人，Electrophoresis, 33:3418-3428 (2012);Venkatesan等人，Nature Nanotechnology, 6:615-624 (2011);然而，這種方法具有其自身的一套技術(shù)困難，諸如，可 靠的納米孔制造、DNA移位率的控制、核苷酸區(qū)分、對(duì)來(lái)自納米孔傳感器的大型陣列的電信 號(hào)的檢測(cè)等等，例如，Branton等人，NatureBiotechnology, 26 (10) : 1146-1153 (2008); Venkatesan等人（以上引用）。
[0005] 核苷酸的光學(xué)檢測(cè)已經(jīng)作為納米孔測(cè)序領(lǐng)域中的一些技術(shù)困難的潛在的解決方 案被提出，例如Huber,國(guó)際專利公布W0 2011/040996 ;Russell,美國(guó)專利6, 528, 258; Pittaro,美國(guó)專利公布2005/0095599Joyce，美國(guó)專利公布2006/0019259 ;Chan，美國(guó)專 利 6, 355, 420;McNally等人，NanoLett.，10 (6) : 2237-2244 (2010)等等。然而，由于多種 原因，并未實(shí)現(xiàn)基于光學(xué)的納米孔測(cè)序，所述多種原因包括缺乏合適的制造技術(shù)以及缺乏 對(duì)此類系統(tǒng)的元件如何相互作用的認(rèn)識(shí)。
[0006] 鑒于上述內(nèi)容，如果存在允許對(duì)分析物諸如核酸的序列的成功的光學(xué)感測(cè)和分析 的光學(xué)元件的可用的材料和配置，這對(duì)于通常的納米孔傳感器技術(shù)和其特定應(yīng)用，諸如基 于光學(xué)的納米孔測(cè)序?qū)⑹怯欣摹?br>[0007] 概述
[0008] 本文提供了在微流控和/或納米流控裝置中光學(xué)檢測(cè)和分析諸如多核苷酸的聚 合物用于確定核酸的序列的多種方法，所述微流控和/或納米流控裝置諸如使用納米孔的 那些。
[0009] 在某些變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過(guò)納米孔，以便多核苷酸的核苷酸 順序經(jīng)過(guò)與納米孔毗鄰放置的FRET對(duì)的第一成員，當(dāng)核苷酸離開(kāi)納米孔時(shí)多個(gè)核苷酸處 于FRET對(duì)的第一成員的FRET距離內(nèi)并且核苷酸的至少一部分被FRET對(duì)的第二成員標(biāo)記； (b)使與納米孔毗鄰的FRET對(duì)暴露于光束以便FRET在FRET距離內(nèi)的FRET對(duì)的第一成員 與多個(gè)第二成員之間發(fā)生以產(chǎn)生混合的FRET信號(hào)；(c)當(dāng)多核苷酸移位穿過(guò)納米孔時(shí)測(cè)量 混合的FRET信號(hào)；以及（d)從混合的FRET信號(hào)確定多核苷酸的核苷酸序列。在一些實(shí)施 方案中，納米孔被布置在固相膜中并且FRET對(duì)的第一成員附接至固相膜，與所述納米孔毗 鄰。在其他實(shí)施方案中，納米孔是蛋白質(zhì)納米孔并且FRET對(duì)的第一成員附接至蛋白質(zhì)納米 孔。
[0010] 在另一變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過(guò)具有出口的納米孔，以便多核苷 酸的核苷酸在離開(kāi)納米孔后順序通過(guò)FRET區(qū)域，F(xiàn)RET區(qū)域在此通過(guò)期間包含多個(gè)核苷酸 并且核苷酸的至少一部分被FRET對(duì)的至少一個(gè)第二成員標(biāo)記并且FRET對(duì)的至少一個(gè)第一 成員處于FRET區(qū)域內(nèi)；(b)使FRET區(qū)域內(nèi)的FRET對(duì)的第一成員和第二成員暴露于光束以 便FRET在FRET對(duì)的第一成員和第二成員之間發(fā)生以產(chǎn)生混合的FRET信號(hào)；（c)當(dāng)多核苷 酸移動(dòng)穿過(guò)FRET區(qū)域時(shí)測(cè)量混合的FRET信號(hào)；以及（d)從混合的FRET信號(hào)確定多核苷酸 的核苷酸序列。
[0011] 在另一變化形式中，一種確定多核苷酸的核苷酸序列的方法包括以下步驟：(a) 使具有標(biāo)記的核苷酸的多核苷酸，例如單鏈多核苷酸或雙鏈多核苷酸移位穿過(guò)納米孔，所 述納米孔被定制尺寸（dimension)以便核苷酸上的標(biāo)記物被限制以抑制FRET反應(yīng)，核苷酸 上的標(biāo)記物作為FRET對(duì)的第二成員，并且以便多核苷酸的核苷酸在離開(kāi)納米孔后順序通 過(guò)FRET區(qū)域，F(xiàn)RET區(qū)域在此通過(guò)期間包含多個(gè)核苷酸并且FRET對(duì)的至少一個(gè)第一成員處 于FRET區(qū)域內(nèi)；(b)使FRET區(qū)域內(nèi)的FRET對(duì)的第一成員和第二成員暴露于光束以便FRET 在第一成員和第二成員之間發(fā)生以產(chǎn)生混合的FRET信號(hào)；（c)當(dāng)多核苷酸移動(dòng)穿過(guò)FRET 區(qū)域時(shí)測(cè)量混合的FRET信號(hào)；以及（d)從混合的FRET信號(hào)確定多核苷酸的核苷酸序列。
[0012] 在許多實(shí)施方式和應(yīng)用中例證了多種方法、系統(tǒng)和裝置，其中的一些被總結(jié)如下 并且貫穿本說(shuō)明書(shū)。
[0013] 附圖簡(jiǎn)述
[0014] 圖1A示意性地闡明了具有對(duì)用單一種類的受體分子標(biāo)記的多核苷酸分析物進(jìn)行 的混合的FRET信號(hào)采集的一個(gè)實(shí)施方案。
[0015] 圖1B顯示了用單一種類的受體分子標(biāo)記的測(cè)試多核苷酸的混合的FRET信號(hào)的數(shù) 據(jù)。
[0016] 圖1C示意性地闡明了具有對(duì)用兩種受體分子標(biāo)記的多核苷酸分析物進(jìn)行的混合 的FRET信號(hào)采集的另一個(gè)實(shí)施方案。
[0017] 圖1D顯示了用兩種受體分子標(biāo)記的測(cè)試多核苷酸的混合的FRET信號(hào)的數(shù)據(jù)。
[0018] 圖2A至2C闡明了雜合生物傳感器的一個(gè)實(shí)施方案。
[0019] 圖2D闡明了通過(guò)使用寡核苷酸雜交來(lái)放置FRET對(duì)的成員的裝置的實(shí)施方案。
[0020] 圖2E闡明了雜合納米孔的一個(gè)實(shí)施方案，其中固態(tài)膜（201)的表面涂覆了疏水性 層（202)，脂質(zhì)層（203)粘附于疏水性層（202)上。脂質(zhì)與插入的孔蛋白質(zhì)形成千兆歐姆封 接（gigaohmseal)〇
[0021] 詳述
[0022] 雖然本文描述的多種方法、系統(tǒng)和裝置服從于多種修改形式和替代形式，其細(xì)節(jié) 已經(jīng)通過(guò)舉例顯示于附圖中并且將被詳細(xì)描述。然而應(yīng)該理解的是，意圖并非限制于所描 述的具體的實(shí)施方案。相反，意圖覆蓋落在本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)的所有修改形式、等價(jià)物 和替代物。例如，為了闡明的目的顯示了具體的納米孔類型和數(shù)目、具體的標(biāo)記物、FRET對(duì)、 檢測(cè)方案和制造方法。然而應(yīng)該領(lǐng)會(huì)的是，本公開(kāi)內(nèi)容并非意圖被限制在這一方面，因?yàn)榭?以利用其他類型的納米孔、納米孔陣列和其他的制造技術(shù)來(lái)實(shí)施本文所討論的系統(tǒng)的多個(gè) 方面。關(guān)于某些方面的指導(dǎo)見(jiàn)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所熟知的許多可得的參考文獻(xiàn)和論 述中，包括，例如，Cao，Nanostructures&Nanomaterials(Impe;rialCollegePress, 2004); Levinson,PrinciplesofLithography，第二版（SPIEPress, 2005);Doering和Nishi,編 輯，HandbookofSemiconductorManufacturingTechnology,第二版（CRCPress, 2007)； Sawyer等人，ElectrochemistryforChemists,第2版(WileyInterscience, 1995)； Bard和Faulkner,ElectrochemicalMethods:FundamentalsandApplications,第 2版(Wiley, 2000) ；Lakowicz,PrinciplesofFluorescenceSpectroscopy,第3版 (Springer, 2006) ；Hermanson,BioconjugateTechniques,第二版（AcademicPress, 2008) 等等，其相關(guān)部分通過(guò)引用并入本文。
[0023] 本文所描述的多種方法和系統(tǒng)涉及使用納米孔和FRET對(duì)以測(cè)量分析物，諸如聚 合物分析物的性質(zhì)。FRET對(duì)通常是一個(gè)或更多個(gè)FRET供體和一個(gè)或更多個(gè)FRET受體， 其中每一個(gè)供體能夠與每一個(gè)受體發(fā)生FRET反應(yīng)。在一方面，這意味著，F(xiàn)RET對(duì)的供體 具有與受體的吸收光譜基本上重疊的發(fā)射光譜。在另一方面，供體和受體的躍迀偶極子 (transitiondipole)必需以允許有效能量轉(zhuǎn)移的方式對(duì)齊（aligned)。某些變化形式部 分地基于在以下條件下使用FRET對(duì)的識(shí)別和鑒別：其中在檢測(cè)事件期間多個(gè)FRET受體產(chǎn) 生FRET信號(hào)以便混合的FRET信號(hào)被收集。在一些方面，某些變化形式部分地還基于對(duì)納 米孔的FRET抑制性質(zhì)的發(fā)現(xiàn)和鑒別，和應(yīng)用該性質(zhì)以使得能夠檢測(cè)移位穿過(guò)納米孔的標(biāo) 記的分析物。人們認(rèn)為，盡管本文描述的變化形式并不意圖因此被限制，可選擇具有定制尺 寸的孔洞（bore)的納米孔以便FRET對(duì)的標(biāo)記物在移位穿過(guò)納米孔時(shí)不能夠定向參與FRET 相互作用?；诩{米孔的經(jīng)限制的直徑，納米孔的孔洞中的多核苷酸的標(biāo)記物的偶極子在 其轉(zhuǎn)動(dòng)自由度方面被限制。偶極子對(duì)齊與附接至納米孔的相應(yīng)的FRET對(duì)的對(duì)齊的該減少 極大地限制了FRET的效率。標(biāo)記的多核苷酸可以在離開(kāi)納米孔之后參與FRET相互作用， 屆時(shí)分析物（例如多核苷酸）上的FRET受體或供體恢復(fù)轉(zhuǎn)動(dòng)自由度，這允許混合的FRET 事件。
[0024] 取決于被檢測(cè)的分析物的類型、所采用的供體和受體的類型、納米孔、供體和受體 的物理排列、分析物是否被供體或受體標(biāo)記等等，涵蓋了廣泛范圍的實(shí)施方案。在一個(gè)實(shí)施 方案中，測(cè)量的分析物是受體標(biāo)記的聚合物，特別是受體標(biāo)記的多核苷酸。在后一實(shí)施方案 的一個(gè)種類中，多核苷酸分析物的不同核苷酸被一種或更多種不同種類的受體標(biāo)記，使得 多核苷酸的核苷酸序列可以通過(guò)測(cè)量當(dāng)其移位穿過(guò)納米孔時(shí)產(chǎn)生的混合的FRET信號(hào)來(lái)確 定。在另一種實(shí)施方案中，測(cè)量的分析物是供體標(biāo)記的聚合物，特別是供體標(biāo)記的多核苷 酸。多核苷酸的序列可以通過(guò)測(cè)量當(dāng)其移位穿過(guò)納米孔時(shí)的混合的FRET信號(hào)來(lái)確定。在 又另一個(gè)實(shí)施方案中，多核苷酸分析物的四種核苷酸的至少一種被FRET對(duì)的成員標(biāo)記。被 標(biāo)記的核苷酸在多核苷酸中的位置通過(guò)使標(biāo)記的多核苷酸移位穿過(guò)標(biāo)記的納米孔并測(cè)量 FRET事件來(lái)確定。通過(guò)標(biāo)記同一多核苷酸樣品的剩余的核苷酸以及隨后使所述樣品移位 穿過(guò)標(biāo)記的納米孔，產(chǎn)生多核苷酸的子序列。此類子序列可以被重新排列，產(chǎn)生多核苷酸的 全部序列。圖1A中示意性地闡明了以上方面和實(shí)施方案的一些。聚合物分析物（1000)，諸 如多核苷酸，被例如電泳驅(qū)動(dòng)穿過(guò)納米孔（1002)，所述納米孔（1002)限制聚合物（1000)的 構(gòu)象以便其單體單元以與其在聚合物中的一級(jí)序列相同的順序移位穿過(guò)納米孔。此外，如 以上提及的，每當(dāng)受體標(biāo)記的單體單元處于納米孔（1002)的孔洞中時(shí)，此類受體與其FRET 對(duì)中的供體（例如1012)之間的FRET相互作用被抑制。此抑制通常意味著，即使此類受體 處于供體的FRET距離內(nèi)，由于受體和供體的偶極子的不利的定向，不會(huì)產(chǎn)生可檢測(cè)的FRET 信號(hào)。另一方面，一旦受體標(biāo)記的單體單元從納米孔的孔洞中脫離進(jìn)入FRET區(qū)域（1008)， 強(qiáng)FRET信號(hào)立刻產(chǎn)生（由于供體（1012)的接近），之后隨著受體和供體之