的吸收能量可以根據核酸標記物的吸收能量調整，以控制 能量轉移藉以可在兩種標記物之間發(fā)生的距離?？讟擞浳锟梢猿掷m(xù)至少1〇~6或ΚΓ9的激 發(fā)和能量轉移循環(huán)是穩(wěn)定的且有功能的。
[0048] 處理固相臘以減小自體熒光
[0049] 在一些實施方案中，用低能量離子束處理微機電系統(tǒng)（MEMS)材料的固相膜以漂 白其自體熒光。通常通過指導離子束至MEMS材料的表面區(qū)域進行這樣的處理，所述離子束 以足夠高的能量以在MEMS材料的表面或鄰近其表面引起MEMS材料中的物理變化以破壞有 助于自體熒光的結構或使其失活，但不以發(fā)生融化、汽化、顯著的變形或噴濺這樣的能量。 所需的最小能量通過從零開始逐漸地增加光束能量并測量隨著增加的光束能量的自體熒 光的減少可容易地在逐個材料（material-by-material)的基礎上確定。如本文所用的，術 語"自體熒光"與"背景熒光"同義，被用于指當用選擇的以激發(fā)不是MEMS材料的部分的熒 光標記物的光源激發(fā)后，從位于或接近MEMS材料的表面的源發(fā)出的熒光。因此，MEMS材料 中的自體熒光取決于光源的頻率。在一方面，選擇光源的頻率以激發(fā)有機熒光染料，使得該 方法減少在可見光范圍內的頻率以及從近紅外到近紫外的頻率的自體熒光。MEMS材料包括 能夠微加工的并且在使用光學檢測的分析技術中使用的多種固體。示例性的MEMS材料是 基于硅的基質，諸如氮化硅和二氧化硅或基于金屬的基質，諸如氧化鋁。在一方面，MEMS材 料以膜的形式被加工和使用。在一個實施方案中，MEMS材料是氮化硅?？刹捎枚喾N聚焦離子 束用于這樣的漂白并且用于多種能量的此類光束的產生和應用的指導可見于諸如Natasi等人，IonSolidInteractionsfundamentalsandApplications(CambridgeUniversity Press，1996)的參考文獻和類似參考文獻。示例性的聚焦離子束包括氦離子束、氖離子束 和鎵離子束。在一個實施方案中，在該方法中使用氦離子束。氦離子束可以通過市售可得 的離子束顯微鏡0ΠΜ)(例如，ZeissOrionNanofab)產生。遞送至MEMS材料諸如氮化硅 的表面以減少自體熒光的能量或劑量的量可以在從2e-10nC/nnT2至8e-10nC/nnT2的范圍 內。
[0050] 用于納米孔和分析物的標iP,物
[0051] 在一些實施方案中，可以用一種或更多種量子點標記納米孔。特別地，在一些實施 方案中，一種或更多種量子點可附接至納米孔，或附接至與納米孔毗鄰（并且在納米孔的 入口或出口的FRET距離之內）的固相支撐物上，并且被采用作為與分析物上的受體的FRET 反應中的供體。量子點的此類用途是公知的并且被廣泛描述于科學文獻和專利文獻中，諸 如，描述于美國專利6, 252, 303、6, 855, 551、7, 235, 361等等中，其通過引用被并入本文。
[0052] 可被用作孔標記物的量子點的一個實例是可在水性溶液中合成的CdTe量子點。 可用親核基團諸如伯胺、巰基或諸如羧酸的官能團使CdTe量子點功能化。CdTe量子點可 包括巰基丙酸加帽的配體，其具有可用于將量子點共價地連接至蛋白質孔外部的伯胺的羧 酸官能團。可使用生物綴合領域內普通技術人員已知的標準的交聯試劑（同-雙功能的和 異-雙功能的）完成交聯反應。必須小心以確保修飾不會損害或基本上不會損害核酸移位 穿過納米孔。這可以通過改變用于將供體標記物附接至納米孔的采用的交聯劑分子的長度 來實現。
[0053]可使用天然α溶血素蛋白（Song,L.等人，Science274,（1996) :1859-1866)的 賴氨酸殘基131的伯胺以通過1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳二亞胺鹽酸鹽/N-羥基 硫代琥珀酰亞胺（EDC/NHS)偶聯化學反應共價結合羧基修飾的CdTe量子點。可選地，氨基 酸129 (蘇氨酸）可以被交換為半胱氨酸。因為在天然α溶血素蛋白中不存在其他半胱氨 酸殘基，新插入的半胱氨酸的巰基側基可以被用于共價附接其他化學部分。
[0054] 用于將一種或更多種的孔標記物附接至孔蛋白質的多種方法、機制和/或途徑可 以被利用?？椎鞍踪|可以以將具有已知性質或多種官能團的氨基酸引入天然蛋白質序列的 方式被遺傳工程化。天然存在的蛋白質序列的此修飾可以有利于將量子點與孔蛋白質的生 物綴合。例如，半脫氣酸殘基的引入將引入疏基基團，其將允許量子點諸如WTe量子點與 孔蛋白質的直接結合。并且，賴氨酸殘基的引入會引入用于結合量子點的伯胺。谷氨酸或 天冬氨酸的引入會引入用于結合量子點的羧酸部分。這些基團服從于使用同-或異-雙功 能交聯劑分子與量子點的生物綴合。多組氨酸的插入允許量子點經由金屬-組氨酸配位與 蛋白質孔的直接結合。目的在于引入用于生物綴合的官能團的對孔蛋白質的此類修飾，是 本領域普通技術人員已知的。應小心以確保修飾不會損害或基本上不會損害核酸移位穿過 納米孔。
[0055] 可以在將所述納米孔插入脂質雙層之前或之后將納米孔標記物附接至蛋白質納 米孔。當標記物在插入脂質雙層之前被附接的情況下，必須小心標記納米孔的底部并且避 免孔蛋白質的隨機標記。這可以通過孔蛋白質的遺傳工程化來實現，以允許孔標記物的位 點特異性附接（參見0047部分）。此方法的優(yōu)點是標記的納米孔的批量制備?？蛇x地，預 插入的納米孔的標記反應可確保標記物與納米孔的底部（反側）位點特異性附接而不需要 遺傳工程化孔蛋白質。
[0056] 生物聚合物，例如核酸分子或聚合物，可以用一種或更多種受體標記物標記。對于 核酸分子，核酸分子的四種核苷酸或構件的每一種可以用一種受體標記物標記，從而創(chuàng)建 每一種天然存在的核苷酸的標記的（熒光）對應物。受體標記物可以以接受能量的分子 的形式，所述接受能量的分子可被附接至轉換的核酸的部分或整條鏈的一個或更多個核苷 酸。
[0057] 多種方法可被用來標記核酸分子或聚合物的單體或核苷酸。標記的核苷酸可以在 使用原始樣品作為模板合成新的核酸期間被摻入核酸（"通過合成標記"）。例如，核酸的 標記可以通過PCR、全基因組擴增、滾環(huán)擴增、引物延伸等或通過本領域普通技術人員已知 的以上方法的多種組合和擴展形式來實現。
[0058] 核酸的標記可通過在具有標記物的修飾的核苷酸類似物的存在下復制核酸來實 現，其導致將所述標記物摻入新產生的核酸。標記過程還可通過摻入具有官能團的核苷酸 類似物來實現，所述官能團可用于在第二標記步驟中共價附接接受能量的部分。可通過全 基因組擴增（Zhang，L.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA89(1992):5847)或鏈置換擴增諸 如滾環(huán)擴增、缺口平移、轉錄、逆轉錄、引物延伸和聚合酶鏈式反應（PCR)、簡并性寡核苷酸 引物PCR(DOP-PCR)(Telenius，H.等人，Genomics13(1992):718-725)或以上方法的組合 實現這樣的復制。
[0059] 標記物可包括反應性基團，諸如親核試劑（胺、巰基等等）。不存在于天然核酸中 的此類親核試劑，隨后可被用于通過胺或巰基反應化學諸如NHS酯、馬來酰亞胺、環(huán)氧環(huán)、 異氰酸酯等附接熒光標記物。此類親核試劑反應性熒光染料（即，NHS-染料）從不同來源 是容易市售可得的。當使用"通過合成標記"方法時，用小的親核試劑標記核酸的優(yōu)點在于 高效摻入此類標記的核苷酸。由于聚合過程期間標記物的空間位阻，以大體積熒光標記的 核酸構件可能通過聚合酶不理想地摻入新合成的DNA。
[0060]DNA可以被直接化學修飾而不需要聚合酶介導的標記的核苷酸的摻入。修飾 的一個實例包括修飾鳥嘌呤堿基的N7位置的含有順鉑的染料（Hoeve1，T.等人，Bio Techniques27(1999) : 1064-1067)。另一個實例包括用羥胺修飾嘧啶的C6位置，其產生 6_羥氨基衍生物。產生的胺基可用胺反應性染料（例如，NHS-Cy5)進一步修飾。又另一 個實例是疊氮化物或炔烴修飾的核苷酸，其通過聚合酶容易地摻入（Gierlich等人，Chem. Eur.J.，2007, 13, 9486-0404)。遵循良好建立的點擊化學反應方案，炔烴或疊氮化物修飾的 多核苷酸隨后用疊氮化物或炔烴修飾的熒光團標記。
[0061] 核酸分子可以用N-溴代丁二酰亞胺直接修飾，其在與核酸反應后將產生5-溴半 胱氨酸（5-Bromocystein)、8_溴腺噪呤和8-溴鳥噪呤。修飾的核苷酸可進一步與二-胺親 核試劑反應。隨后，剩余的親核試劑可與胺反應性染料（例如，NHS-染料）反應（Hermanson G.于BioconjugateTechniques中，AcademicPress1996,ISBN978-0-12-342336-8)。
[0062] 核酸鏈中1、2、3或4種核苷酸的組合可以被它們的標記的對應物交換?？善叫袦y 序標記的核苷酸的多種組合，例如，除了四種單一標記的樣品外用2種標記的核苷酸的組 合標記源核酸或DNA，其將產生總共10種不同標記的樣品核酸分子或DNA(G、A、T、C、GA、GT、 GC、AT、AC、TC)。得到的序列模式由于在冗余序列讀出中重疊的核苷酸位置，可允許更準確 的序列比對。
[0063] 在某些變化形式中，用于測序聚合物諸如核酸分子的方法，可包括提供插入膜或 膜樣結構或其他基質中的納米孔或孔蛋白質（或合成的孔）?？椎牡撞炕蚱渌糠挚梢员?一種或更多種孔標記物修飾。所述底部可以指孔的反式側。任選地，孔的順式側和/或反 式側可以用一種或更多種孔標記物修飾。待分析或待測序的核酸聚合物可用作模板，用于 產生標記版本的核酸聚合物，其中在所得聚合物中四種核苷酸的一種或多達所有四種核苷 酸被核苷酸的標記的類似物代替。對納米孔施加電場，其迫使標記的核酸聚合物穿過納米 孔，同時外部的單色或其他光源可被用于照明納米孔，從而激發(fā)孔標記物。在核酸的標記的 核苷酸通過、離開或進入納米孔時、之后或之前，能量從孔標記物轉移至核苷酸標記物，其 導致較低能量輻射的發(fā)射。核苷酸標記物輻射隨后通過共聚焦顯微鏡裝置或本領域普通技 術人員已知能夠進行單分子檢測的其他光學檢測系統(tǒng)或光顯微術系統(tǒng)來檢測。此類檢測 系統(tǒng)的實例包括但不局限于共聚焦顯微鏡術、落射焚光顯微鏡術和全內反射焚光顯微鏡術 (TIRE)。具有標記的單體的其他聚合物（例如，蛋白質和核酸以外的聚合物）也可以根據 本文描述的方法被測序。
[0064] 當聚合物的受體標記的單體（例如，核苷酸）的受體標記物在標記的單體離開、 進入或通過納米孔時、之后或之前與供體標記物反應時，能量可從孔或納米孔供體標記物 (例如，量子點）轉移至聚合物（例如，核酸）上的受體標記物。例如，供體標記物可位于納 米孔的順式側或反式側或表面上或在納米孔的順式側或反式側或表面上附接至納米孔，使 得供體標記物和受體標記物之間的相互作用或能量轉移直到標記的單體離開納米孔并且 進入納米孔通道或開口外部的供體標記物的周圍或附近才發(fā)生。作為結果，標記物之間的 相互作用、從供體標記物到受體標記物的能量轉移、來自受體標記物的能量發(fā)射和/或來 自受體標記物的能量發(fā)射的測量或檢測可在穿過納米孔的通道、通路或開口的外部發(fā)生， 例如，在納米孔的順式側或反式側上的順式室或反式室之內發(fā)生。從單體的受體標記物發(fā) 射的能量的測量或檢測可以用來鑒定單體。
[0065] 納米孔標記物可放置于納米孔的通路、通道或開口的外部使得標記物可以是可見 的或可以被暴露以便于標記物的激發(fā)或照射。供體標記物和受體標記物之間的相互作用和 能量轉移以及由于能量轉移而從受體標記物的能量發(fā)射，可以在納米孔的通路、通道或開 口的外部發(fā)生。這可以促進檢測或測量來自受體標記物的能量或光發(fā)射的簡便性和準確 度，所述檢測或測量例如通過光學檢測或測量裝置。供體和受體標記物相互作用可在納米 孔的通道內發(fā)生并且供體標記物可放置于納米孔的通道內。
[0066] 供體標記物可以以多種方式和/或在納米孔上的多個位點處附接。例如，供體標 記物可以直接或間接附接或連接至納米孔的部分或單元上?？蛇x地，供體標記物可以與納 米孔毗鄰放置。
[0067] 聚合物（例如，核酸）的每一個受體標記的單體（例如，核苷酸）可以與供體標記 物順序地相互作用，所述供體標記物放置于聚合物移位穿過的納米孔或通道上或緊鄰其或 直接或間接附著至其。供體和受體標記物之間的相互作用可發(fā)生在納米孔通道或開口的外 部，例如，在受體標記的單體離開納米孔后或在單體進入納米孔之前發(fā)生。相互作用可發(fā)生 在或部分發(fā)生在納米孔通道或開口之內，例如當受體標記的單體經過、進入或離開納米孔 時發(fā)生。
[0068]當核酸的四種核苷酸的一