基于fix的抗原表位及其應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體地涉及一種基于FIX的抗原表位及其應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] FIX是凝血系統(tǒng)中參與凝血級聯(lián)反應(yīng)的一個重要的維生素K依賴的糖蛋白，它在 人體內(nèi)的缺乏或不足將導(dǎo)致血友病B。終身輸注FIX制劑是血友病B最主要的治療途徑， 也就是說血友病B患者終身都離不開FIX的治療，因此，獲得高安全性的hFIX對于血友病 B病人來說是非常重要的。
[0003] FIX的主要來源途徑是從健康人血漿中純化FIX(P化FI訝和通過基因工程技術(shù)制 備重組FIX(riiFIX)。傳統(tǒng)的P化FIX純化方法包括磯酸巧吸附法、氨氧化鉛吸附法、離子交 換法和肝素親和純化法等。由于血液中hFIX的濃度非常低（健康人血漿中hFIX濃度約為 5Ug/mL)，且送類凝血蛋白的物理化學(xué)性質(zhì)又十分相似，因此，送些傳統(tǒng)方法制備的hFIX 純度總是很低，常含有FII、FVII、FX和蛋白C等，由于血友病人需要終生用藥，因此，反復(fù) 注射送種低純度的hFIX制劑會有增加血栓形成和發(fā)生血栓栓塞的危險。少數(shù)的一些方法 雖然能夠制得純度較高的hFIX,但是由于其成本高或者回收率低，無法應(yīng)用于hFIX的工業(yè) 化生產(chǎn)中。在riiFIX研制方面，已有通過牛乳系統(tǒng)成功表達(dá)出了有活性的riiFIX的報道，但 是在其規(guī)?；蛛x純化方面，至今仍未能找到有效的方法。所嘗試的一些方法，包括離子 交換層析、肝素親和層析或者幾種方法串聯(lián)使用等，均未能取得良好的結(jié)果，往往不是使得 rhFIX失活就是因步驟繁多導(dǎo)致回收率極低或者純度過低。因此，研究出一種高效且適宜于 的FIX(包括P化FIX和riiFI訝規(guī)?；兓姆椒ū阒陵P(guān)重要且迫在眉睫。
[0004] 免疫親和層析因其高特異性和高純化效率被認(rèn)為是純化抗原的潛在理想方法，而 它成功的關(guān)鍵首先在于是否能夠制得足量特異性好且親和力適中的抗hFIX抗體。1984年， Liebman等通過制備Ca2M衣賴型的單克隆抗體來純化hFIX,結(jié)果，經(jīng)一步純化便獲得了特異 凝血活性高達(dá)150IU/mg的純hFIX,回收率高，而且該單克隆抗體與hFIX的結(jié)親和力較為 溫和，送樣便保證了hFIX的活性。但是，該單克隆抗體造價昂貴、制備周期很長，限制了其 在hFIX規(guī)?；a(chǎn)中的應(yīng)用。多克隆抗體可被用于抗原的純化，而且制備簡單，但是由于 普通的多克隆抗體是由多個B表位產(chǎn)生的抗體混合物，性質(zhì)不均一，且親和力非常強，當(dāng)它 用于純化時，洗脫條件難易掌握，且往往由于過于嚴(yán)苛的洗脫條件致使目標(biāo)蛋白失活。另一 方面，多抗的特異性往往比較低，當(dāng)它用來純化牛乳中的rhFIX的時候，很可能會與牛內(nèi)源 性FIX化FI訝發(fā)生非特異性結(jié)合，從而導(dǎo)致純化的產(chǎn)物安全性降低，因此，它不適宜用來純 化hFIX(包括P化FIX和riiFI訝。因此，要解決送兩種抗體用于純化hFIX存在的問題，就需 要找到一種新的抗hFIX抗體制備方法，使其能夠產(chǎn)生足量特異性好且親和力溫和的抗體， 從而使它能夠用于hFIX的規(guī)?；庖哂H和純化，得到高純度且保持凝血活性的hFIX。
[0005] 作為用于純化抗原的抗體，它識別的并不是整個抗原分子，而是抗原分子中的B 表位。研究表明，抗體的特異性與抗原的特異性相關(guān)，而抗原的特異性實際上指的是表位的 特異性。因此獲得特異性好、親和力適中的抗原表位是制備純化抗體的關(guān)鍵。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于提供一種基于FIX的抗原表位膚及其應(yīng)用，該抗原表位膚與載 體蛋白融合后能激發(fā)起較強的體液免疫反應(yīng)，產(chǎn)生特異性針對FIX的抗體。
[0007] 本發(fā)明的另一目的是提供一種特異性識別并結(jié)合人FIX的抗體及FIX抗體的制備 方法，該抗體可用于人FIX的分離純化、檢測W及治療與所述抗原表位相關(guān)的疾病。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供了一種抗原表位膚，所述抗原表位膚源自動物FIX且包 含一個或多個抗原表位，
[0009] 并且所述抗原表位膚氨基酸序列長度為FIX全長的2-100% (優(yōu)選地，所述抗原表 位膚氨基酸序列長度為相應(yīng)的低免疫原性蛋白全長的5-70% ;更優(yōu)選地，所述抗原表位膚 氨基酸序列長度為相應(yīng)的低免疫原性蛋白全長的5-50% ;最優(yōu)選地，所述抗原表位膚氨基 酸序列長度為相應(yīng)的低免疫原性蛋白全長的5-30 %，如5 %、10 %、15 %、20 %、25 % )，且所 述抗原表位膚的長度為5-500個氨基酸；
[0010] 并且所述抗原表位膚與載體蛋白形成的重組蛋白可誘發(fā)同一種類的所述動物產(chǎn) 生針對FIX的免疫反應(yīng)。
[0011] 優(yōu)選地，所述抗原表位膚氨基酸序列長度為3-57。更優(yōu)選地，所述抗原表位膚氨基 酸序列長度為 5-17。如 5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17個氨基酸。
[0012] 在另一優(yōu)選例中，所述動物為哺乳動物。如，人、鼠、兔、?；蜓颉?br>[0013] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位膚包括人FIX全長序列、鼠FIX全長序列、兔FIX 全長序列、牛FIX全長序列、羊FIX全長序列或其同源序列。
[0014] 在另一優(yōu)選例中，所述人FIX全長序列如SEQIDNO. : 1所示。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述鼠FIX全長序列如SEQIDNO. :2所示。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述牛FIX全長序列如SEQIDNO. : 3所示。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位膚選自下組：
[001 引（I)MAINKY;
[0019] (2)將（1)中氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成 的，且與載體蛋白融合后具有誘發(fā)免疫反應(yīng)功能的衍生的多膚。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白具有至少一個T細(xì)胞表位，并且在所述載體蛋白 的至少一個分子表面氨基酸殘基區(qū)通過拼接、替換、和/或插入而引入所述的抗原表位膚。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白與所述抗原膚段不是來自同一個蛋白，并且所述 載體蛋白可W增強所述表位膚的免疫原性。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域DTT、霍 亂毒素B亞單位（CTB)、沙口氏菌鞭毛蛋白（Flic)、百日咳毒素（PT訝、破傷風(fēng)毒素、或上述 蛋白的免疫原性片段（如破傷風(fēng)毒素的C片段）、輪狀病毒VP7、利什曼原蟲的熱休克蛋白、 空腸彎曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原體主要外膜蛋白、血藍(lán)蛋白化巧holeLimpet化mo巧anin, KLH)、牛血清白蛋白度ovineSe;rumA化umin，BSA)，雞卵白蛋白（Ova化umin，OVA)，纖維蛋 白原。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述"分子表面氨基酸殘基區(qū)"包括loop區(qū)、beta-tum區(qū)、N末 端或C末端。
[0024] 本發(fā)明的第二方面，提供了一種融合蛋白，所述融合蛋白是如本發(fā)明第一方面所 述的抗原表位膚與載體蛋白融合所形成的。
[0025] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白具有至少一個T細(xì)胞表位，并且在所述載體蛋白 的至少一個分子表面氨基酸殘基區(qū)通過拼接、替換、和/或插入而引入所述的抗原表位膚。
[0026] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白與所述抗原膚段不是來自同一個蛋白，并且所述 載體蛋白可W增強所述表位膚的免疫原性。
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述載體蛋白包括白喉毒素DT、白喉毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域DTT、霍 亂毒素B亞單位（CTB)、沙口氏菌鞭毛蛋白（Flic)、百日咳毒素（PTX)、破傷風(fēng)毒素、或上述 蛋白的免疫原性片段（如破傷風(fēng)毒素的C片段）、輪狀病毒VP7、利什曼原蟲的熱休克蛋白、 空腸彎曲菌鞭毛蛋白、沙眼衣原體主要外膜蛋白、血藍(lán)蛋白化巧holeLimpet化mo巧anin, KLH)、牛血清白蛋白度ovineSe;rumA化umin，BSA)，雞卵白蛋白（Ova化umin，OVA)，纖維蛋 白原。
[0028] 在另一優(yōu)選例中，所述"分子表面氨基酸殘基區(qū)"包括loop區(qū)、beta-tum區(qū)、N末 端或C末端。
[0029]在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白為白喉毒素的跨膜結(jié)構(gòu)域DTT，并且所述的 loop區(qū)包括292-298,305-310位氨基酸。在另一優(yōu)選例中，通過將所述抗原表位膚替換所 述DDT的第292-295位氨基酸制成所述融合蛋白。
[0030] 在另一優(yōu)選例中，所述的載體蛋白為霍亂毒素B亞單位，并且所述的loop區(qū)包 括：
[0031] 霍亂毒素B亞單位（CTB)可植入表位可植入表位29-38位氨基酸
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位膚連接于所述載體蛋白的C末端和/或N末端形 成所述融合蛋白。
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位和所述載體蛋白之間具有連接膚。優(yōu)選地，所述連 接膚長度為3-30個氨基酸。更優(yōu)選地，所述連接膚長度為4-20個氨基酸。最優(yōu)選地，所述 連接膚長度為7-17個氨基酸。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位和所述載體蛋白之間不具有連接膚。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位膚替換DTT中的第292-295位氨基酸形成所述融 合蛋白。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白選自：
[0037] (a)具有SEQIDNO. : 12所示氨基酸序列的多膚；
[0038] 化）將（a)中的每個多膚分別經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而 形成的，且具有誘發(fā)免疫反應(yīng)功能的由（a)衍生的多膚。
[0039] 本發(fā)明的第H方面，提供了一種抗體，所述抗體特異性的結(jié)合本發(fā)明第一方面所 述的抗原表位膚或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白。
[0040] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位膚為NAAINKY。
[00川在另一優(yōu)選例中，所述融合蛋白的氨基酸序列如SEQIDNO. : 12所示。
[0042] 本發(fā)明的第四方面，提供了一種分離的抗原抗體復(fù)合物，其中，形成所述復(fù)合物的 抗原中包含本發(fā)明第一方面所述的抗原表位膚或本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白，所述抗 原表位膚形成抗原表位，所述抗體特異性地結(jié)合于所述抗原表位。
[0043] 在另一優(yōu)選例中，所述抗原表位的氨基酸序列為NAAINKY。
[0044] 本發(fā)明的第五方面，提供了一種多核巧酸，所述的多核巧酸編碼本發(fā)明第一方面 所述的抗原表位膚、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白或本發(fā)明第H方面所述的抗體。
[0045] 本發(fā)明的第六方面，提供了一種表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有本發(fā)明第五方面所 述的所述的多核巧酸。
[0046] 本發(fā)明的第走方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有本發(fā)明第六方面 所述的表達(dá)載體，或者在基因組中整合有本發(fā)明第五方面所述的多核巧酸。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞和真核細(xì)胞。
[004引在另一優(yōu)選例中，所述的宿主細(xì)胞包括大腸桿菌、酵母、C冊細(xì)胞、DC細(xì)胞等。
[0049] 本發(fā)明的第八方面，提供了一種藥物組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第一方面 所述的抗原表位膚、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的所述的抗體、 本發(fā)明第四方面所述的所述的多核巧酸、本發(fā)明第六方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第走 方面所述的所述的宿主細(xì)胞，W及藥學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述的組合物為疫苗。
[0051] 本發(fā)明的第九方面，提供了一種疫苗組合物，所述的組合物含有本發(fā)明第一方面 所述的抗原表位膚、本發(fā)明第二方面所述的融合蛋白、本發(fā)明第H方面所述的所述的抗體、 本發(fā)明第四方面所述的所述的多核巧酸、本發(fā)明第六方面所述的表達(dá)載體或者本發(fā)明第走 方面所述的所述的宿主細(xì)胞，W及免疫學(xué)上可接受的載體和/或輔料。
[0052] 在另一優(yōu)選例中，所述的疫苗組合物還含有佐劑。
[0053] 在另一優(yōu)選例中，所述的佐劑包括氧化鉛、皂巧、quilA、胞壁醜二膚、礦物油或 植物油、基于囊泡的佐劑、非離子嵌段共聚物或DEAE葡聚糖、細(xì)胞因子（包括IL-1、IL-2、 IFN-r、GM-CSF、FIX、IL-12、和CpG)。
[0054] 本發(fā)明的第