血清后，分裝保存于-8(TC冰箱，用ELISA的方法檢測(cè)血清中的特異性抗體效價(jià)，并進(jìn)一 步做Western-Blot驗(yàn)證分析。
[0216] 1. 2化ISSA檢測(cè)抗體產(chǎn)生情況：
[0217] WFIX標(biāo)準(zhǔn)品作為包被抗原，各小組倍比稀釋后的血清作為一抗，分別檢測(cè)針對(duì) FIX抗體的產(chǎn)生情況。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表：
[0218] 表IOHJSA檢測(cè)
[0219]
[0220] 實(shí)驗(yàn)操作：
[0221] 1)包被
[0222] 用CBS包被液將各抗原稀釋至0. 1-1Jig/mL，向每個(gè)酶標(biāo)板的反應(yīng)孔中加入 IOOyL，4°C賠育過(guò)夜，然后通過(guò)洗板機(jī)洗涂5次，每次用洗涂緩沖液（PBS-T)洗涂3分鐘， 洗涂完后，將酶標(biāo)板倒扣，輕輕拍干其中的液體。
[0223] 2)封閉
[0224] 每孔加300UL的封閉液，37C封閉化，用洗涂液洗板5次，洗涂方法與上相同，洗 涂完后輕輕扣干。
[0225] 3)將被測(cè)血清分別用抗體稀釋液作1:100,1:200,1:500,1:1000的稀釋。然后按 上述表格每孔各加入對(duì)應(yīng)血清100U以做3個(gè)并行復(fù)孔，37°C賠育化，洗板5次后將酶標(biāo)板 倒扣，輕輕拍干其中的液體。
[0226] 4)將羊抗鼠IgG-HRP用抗體稀釋液稀釋5000倍，每孔加入該稀釋后的酶標(biāo)二抗 100U以37C賠育比，用洗涂液洗涂5次，后將酶標(biāo)板倒扣，輕輕拍干其中的液體。
[0227] W向每個(gè)反應(yīng)孔中各加入100化新鮮配制的底物溶液，37°C賠育10-30min。視 顏色適時(shí)終止。
[022引 6)向每個(gè)反應(yīng)孔中加入50UL的終止液，用酶標(biāo)儀檢測(cè)其450nm處的吸光值。
[0229] W空白對(duì)照的吸光值調(diào)零，若待測(cè)孔的0〇45。值大于或等于陰性對(duì)照孔的2. 1倍， 則定義為陽(yáng)性值，并將該值下對(duì)應(yīng)的最大血清稀釋倍數(shù)，定義為血清中特異性抗體的效價(jià)。
[0230] 結(jié)果表明，在稀釋倍數(shù)為100時(shí)，陰性對(duì)照組DTT-GST和Al(0H)3的〇〇45。值均為 0. 25左右，而實(shí)驗(yàn)組孤45。最高值為0. 92,為FIX-2-DTT免疫的小鼠血清。其余組0〇45。均 較低，不超過(guò)0. 4。當(dāng)血清稀釋倍數(shù)增加時(shí)，各稀釋倍數(shù)下的0〇45。值仍WFIX-2-DTT組為最 高，并在稀釋倍數(shù)為1000時(shí)，其〇〇45。值仍大于其余組分的最大〇〇45。值，說(shuō)明FIX-2-DTT免 疫的小鼠血清中產(chǎn)生了抗人FIX抗體，而其余組分均未產(chǎn)生針對(duì)FIX的抗體或產(chǎn)生量極低。
[0231] 為進(jìn)一步檢測(cè)FIX-2-DTT組的抗體效價(jià)，進(jìn)一步增加FIX-2-DTT組血清的倍數(shù)，直 到〇〇45。值接近0,或與陰性對(duì)照組在該稀釋倍數(shù)下的〇〇45。值接近。巧Ij量方法與上述ELISA 完全相同。在稀釋倍數(shù)為5000倍時(shí)，F(xiàn)IX-2組的N/P值大于2. 1，而稀釋倍數(shù)，大于5000倍 時(shí)，該比值小于2. 1，因此，測(cè)定FIX-2-DDT組血清的抗體效價(jià)為5000。
[0232] 1. 3.Western-blot檢測(cè)抗體結(jié)合特異性
[0233] 試劑配制：
[0234]轉(zhuǎn)移緩沖液；251111化13 6曰36,0.21甘氨酸，20%甲醇（口冊(cè).3)
[023引 IOmMPBS; 140mMNaCl，2.TmMKCl，IOmM胞2冊(cè)04? 10&0 用皿2?04調(diào)抑到 7. 4。
[023引 洗涂緩沖液（PBS-T) ;IOmMPBS，加 0. 1 %Tween-20,混勻。
[0237] 封閉緩沖液；向PBS-T中加5% (w/v)的脫脂奶粉。
[023引抗體稀釋液體：同封閉液。
[0239] 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如下表：
[0240] 表llWestern-blot檢測(cè)
[0243] 實(shí)驗(yàn)步驟：
[0244] 1)電泳分離樣品
[0245] 識(shí)別膠好壞，用1Xloadingbuffer補(bǔ)齊，預(yù)染色Marker指示轉(zhuǎn)膜效率和標(biāo)志泳 道。
[0246] 2)轉(zhuǎn)膜（槽式濕轉(zhuǎn)）
[0247] 電泳即將結(jié)束的時(shí)候，先準(zhǔn)備好6張濾紙，并將其剪取與電轉(zhuǎn)儀大小一致，等電泳 結(jié)束后，將其放于轉(zhuǎn)移緩沖液中浸泡IOmin左右，同時(shí)，也將膠剝下，切去不含目標(biāo)蛋白的 部分，放入該轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡IOmin左右。立即，剪取與膠大小一致的PVDF膜，先放入甲 醇中浸泡2min左右，然后轉(zhuǎn)入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡Smin左右。平衡完成后，按負(fù)極面（黑色 面）-海綿-3層濾紙-凝膠-PVDF膜-3層濾紙-海綿-正極面（紅色面）的順序裝配轉(zhuǎn)移 H明治，每層加完后，切記用玻璃棒小必趕去氣泡，W防止短路。裝好H明治后，將其至于轉(zhuǎn) 移槽中（黑色面對(duì)黑色面），加入轉(zhuǎn)移緩沖液，并將整個(gè)裝置置于冰浴中，插上電極，300mA 恒流，轉(zhuǎn)膜比。或20V電壓下轉(zhuǎn)膜過(guò)夜（1化W上）。轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜。 按預(yù)先的點(diǎn)樣順序?qū)⒛みM(jìn)行切割。
[0248] 3)用25血PBS-T洗膜3次，每次5min，室溫，搖動(dòng)。
[0249] 4)將膜放于一平皿中，加入25血的封閉緩沖液中，室溫?fù)u動(dòng)賠育比，或或者4°C 靜置過(guò)夜。
[0巧0] 5)用PBS-T洗涂3次，每次5min。
[0巧1] 6)將每個(gè)切割的膜分別置于一 10血離必管中，加入對(duì)應(yīng)的適量各稀釋后的血清， 室溫賠育比，緩慢搖動(dòng)。
[0巧2] 7)用PBS-T洗涂3次，每次5min。
[0巧3] 8)將所有膜一起至于一平皿中，加入適量稀釋后的二抗（羊抗鼠IgG-HRP,稀釋 5000倍），緩慢搖動(dòng)反應(yīng)，室溫賠育比。
[0巧4] 9)用PBS-T洗涂3次，每次5min。
[0255] 10)將膜用去離子水再稍加洗涂，并用干凈的濾紙將其表面的水吸干，然后將混合 好的發(fā)光顯色液小必均勻的滴于膜上，顯色5min左右，選擇合適的曝光時(shí)間，進(jìn)行曝光成 像。
[0巧6] 結(jié)果表明，陽(yáng)性對(duì)照組出現(xiàn)了一條明顯的帶，分子量60KD左右，與FIX標(biāo)準(zhǔn)品分子 量相符。各組血清中，只有FIX-2-DTT組在相同位置出現(xiàn)了一條帶，而其余組均無(wú)目標(biāo)條帶 出現(xiàn)。該結(jié)果與化ISA結(jié)果一致，說(shuō)明FIX-2-DTT免疫小鼠后確實(shí)產(chǎn)了生針對(duì)FIX的抗體。 [0巧7] W上結(jié)果表明，F(xiàn)IX-2是FIX的B表位，將其移植到DTT292 295形成重組蛋白后，具 有良好的免疫原性，免疫小鼠能夠產(chǎn)生針對(duì)完整FIX的抗體。
[0巧引實(shí)施例3抗體制備 [0巧9] 1. 1兔子免疫
[0260] 1)準(zhǔn)備6只3-4個(gè)月大，體重2kg左右的雄性日本大耳白兔子，用于免疫 FIX-2-DTT重組蛋白。
[0261] 2)抗原乳化；根據(jù)所需免疫劑量準(zhǔn)備好蛋白抗原，加入等量的弗氏佐劑，用乳化 儀充分激震混勻。初次免疫使用弗氏完全佐劑，加強(qiáng)免疫使用弗氏非完全佐劑。
[0262] 3)初次免疫每只兔子注射Img乳化好后的抗原。采用多點(diǎn)注射法，分別在兔左頸 部注射6點(diǎn)，左前膠下注射6點(diǎn)，左前肩背注射5點(diǎn)。免疫前用實(shí)驗(yàn)兔固定器固定兔子，耳 緣靜脈取血20-100UL保存作陰性對(duì)照。
[026引 4)加強(qiáng)免疫每只兔子注射0.Smg乳化好后的抗原，同樣采取多點(diǎn)注射法，分別在 兔右頸部注射6點(diǎn)，右前膠下注射6點(diǎn)，右前肩背注射5點(diǎn)。
[0264] 5)兩周后相同的佐劑與抗原混勻，進(jìn)行二次加強(qiáng)免疫，方法同步驟4。
[026引6)于第二次加強(qiáng)免疫一周后，于兔子的耳緣靜脈取血20-100UL，400化pm, 4°C離 必，獲得血清，用ELISA的方法檢測(cè)血清中的特異性抗體效價(jià)，W決定是否繼續(xù)加強(qiáng)免疫。
[0266] 7)如果效價(jià)不高，則繼續(xù)進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫方法與上述加強(qiáng)免疫相同，最多總共 免疫5次停止。
[0267] 8)放血；免疫結(jié)束后，采用頸動(dòng)脈取血的方式采集兔子血液，首先使兔子仰邸于 操作架上并將其頭部固定住，然后用小的布料繩套將其四肢拴住固定起來(lái)。將頭部略放低 一點(diǎn)W便暴露頸部，減去頸部的毛，然后用酒精棉進(jìn)行皮膚消毒。消毒完成后，用手術(shù)刀縱 向切開(kāi)前頸部皮膚長(zhǎng)約IOcm左右，分離皮下結(jié)締組織，當(dāng)氣管兩側(cè)的胸鎖乳突肌完全暴露 出后，用止血謝將皮膚分開(kāi)夾住，剝離皮下組織，露出肌層，用刀柄加W分離，即見(jiàn)搏動(dòng)的頸 動(dòng)脈。小必將頸動(dòng)脈和迷走神經(jīng)剝離長(zhǎng)約5cm，選擇血管中段，用止血謝夾住血管壁周?chē)?筋膜。遠(yuǎn)必端用絲線結(jié)扎，近必端用動(dòng)脈謝夾住，用酒精棉花球消毒血管周?chē)?，用無(wú)菌剪刀 剪一V形缺口。取長(zhǎng)2. 5cm、直徑為1. 6mm塑料管一段，將一端剪成針頭樣斜面，并將此端 插入頸動(dòng)脈中，另一端放入200血無(wú)菌H角瓶?jī)?nèi)。W上程序全部完成后，松開(kāi)止血謝開(kāi)始 放血，用干凈的接收容器收集血液。將收集的血液室溫放置2小時(shí)左右，400化pm,4°C離必 Smin，收集上清即獲得兔子血清。
[026引ELISA檢測(cè)3免后兔子抗血清效價(jià)，結(jié)果表明，經(jīng)H次免疫后，所有兔子的血清中 特異性抗體效價(jià)均達(dá)到1:16000及W上，說(shuō)明每只兔子用FIX-2-DTT免疫都產(chǎn)生了針對(duì)FIX 的目標(biāo)抗體，因此，送也進(jìn)一步驗(yàn)證了前面所鑒定的FIX-2確實(shí)是FIX的一個(gè)B表位。
[0269] 1. 2抗體純化
[0270] 1. 2. 1.抗原親和介質(zhì)制備
[0271] 1)多膚合成：
[027引合成一段包含有目的表位的多膚（多膚序列=Chnynaainkynhd(seqidno. ：27), 其中C為額外加的半脫氨酸，作為與層析介質(zhì)的偶聯(lián)位點(diǎn)；劃線部分為表位序列），該項(xiàng)工 作由上海爲(wèi)利生物有限公司完成。最終合成的多膚純度達(dá)90%。
[027引。多膚偶聯(lián)：
[0274] 將IOmg合成的多膚與2mg經(jīng)漠化氯活化的Se地aroseAFF相偶聯(lián)，制成多膚親和 介質(zhì)。偶聯(lián)條件為37°C，I化。偶聯(lián)反應(yīng)緩沖體系為0. 2MNaHC〇3(p冊(cè).5)。
[0275] 1. 2. 2.抗體純化
[0276] 1)用IOmMPBSpH7. 0的緩沖液將兔子血清稀釋5倍待用（所有兔子的血清很合 均勻）；
[0277] 2)取出上述制備好的多膚親和介質(zhì)（2血）裝入空柱子中，用5倍體積的IOmM PBS(抑7. 0)沖洗柱子，直至流出的液體Azs。值接近零為止；
[027引扣取出經(jīng)IOmMPBS稀釋好后的各只兔子的血清，分別流經(jīng)多膚親和柱進(jìn)行純化， 上樣流速控制在WO. 5mL/min左右，上樣完成后用IOmMPBS(抑7. 0)洗去未結(jié)合的非特異性 蛋白，直至流出液A2S。接近零，流穿全部接收；
[0279] 4)用抑3. 0的Gly-HCl緩沖液洗脫結(jié)合的抗體，收集洗脫出來(lái)的液體（預(yù)先在接 收的容器中加入適量化OH)，立即調(diào)抑至中性；
[0280] W用IOmMPBS(抑7. 0)沖洗介質(zhì)至流出液抑為7. 0后，將流穿溶液再次上樣并洗 脫，反復(fù)多次；收集洗脫液；
[0281] 6)通過(guò)SDS-PAGE檢測(cè)抗體純度；
[0282] 7)通過(guò)BCA定量法測(cè)定抗體的濃度；
[0283] 8)通過(guò)Western-Blot檢測(cè)抗體結(jié)合特異性。
[0284] 經(jīng)多膚免疫親和層析，最終純化得到ISmg特異性的目標(biāo)抗體。
[0285] 1.SWestern-Blot檢測(cè)
[0286] 分別W普通牛奶脫脂乳，轉(zhuǎn)基因牛奶脫脂乳（該脫脂乳中含有riiFIX，獲自上海兒 童醫(yī)院遺傳研究所，可參考文獻(xiàn)，黃贊等；山羊-酪蛋白基因啟動(dòng)子指導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因小鼠乳汁 高效表達(dá)人凝血因子IX.遺傳學(xué)報(bào) 2002, 29(3) :206-211;YanJ-B等：Transgenicmicecan expressmutanthumancoagulationfactorIXwithhigherlevelofclottingactivity. Biochemicalgenetics2006, 44(7-8) :347-358) 〇
[0287] hFIX標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自EnzymeResearchL油oratories)，凝血酶原復(fù)合物（PCC,購(gòu)自 華蘭生物）和牛FIX(購(gòu)自EnzymeResearchL油oratories)作為檢測(cè)抗原，W純化所得的 抗體作為一抗（將上