一種阿膠及其衍生產品高純度dna的提取試劑盒及其提取方法
【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于食品檢測技術領域，具體設及一種阿膠及其衍生產品高純度DNA的提 取試劑盒及其提取方法。
【背景技術】
[0002] 現(xiàn)代藥典將阿膠定義為：W馬科動物驢的皮經煎煮、濃縮制成的固體膠。其味甘、 平，入肺、肝、腎經，具有補血止血、滋陰潤燥等功效，藥食兩用。目前阿膠市場價格大幅上 漲，各地均出現(xiàn)了用其他動物皮熬制的代用品，采用骨膠、雜皮等熬制的膠類假藥不僅臨床 效果差，而且還可能出現(xiàn)中毒現(xiàn)象。就驢皮膠或馬皮膠或牛皮膠等外觀來看十分相似，難W 辨別。加之造假者多W在驢皮中滲入部分雜皮膠，使得阿膠的鑒別更是難上加難。目前較 前沿的鑒別方法為分子鑒定法，即將阿膠的DNA提取出來，利用分子生物學手段（如PCR技 術）檢測所提取DNA的動物來源，W確定阿膠的真?zhèn)?。但由于阿膠本身屬于蛋白質成分高 且黏性大的物質，致使DNA提取較難，而且其在制作過程中，原料經反復熬煮，致使DNA部分 遭到破壞，更增加了DNA提取的難度。近幾年，阿膠衍生產品如阿膠糕、阿膠液等大量涌現(xiàn)， 其阿膠成分的含量進一步降低，致使其DNA提取的難度進一步加大。
[000引從成分復雜的阿膠及其衍生產品中提取的DNA，其中多含有能干擾PCR的抑制物， 容易導致DNA檢測失敗（假陰性）。大部分PCR抑制因子（蛋白質、多糖、酪類、脈、腐酸和 血紅素等）都與DNA有相似的溶解性，使用經典DNA提取方法（CTAB/SDS，蛋白酶和酪-氯 仿-異戊醇處理）不容易完全除去，運些物質成了DNA最終提取液的污染物。此外，經典 DNA提取方法中使用的酪、氯仿等有機試劑具有較大的毒性和腐蝕性，存在危害檢驗人員身 屯、健康的風險。除經典DNA提取方法外，發(fā)明專利（【申請?zhí)枴緾N201410317118. 7)還公開了 一種從阿膠中快速提取DNA的試劑盒及其提取方法，但該試劑盒中所用試劑種類較多，價 格昂貴，且個別試劑稀缺不容易購買，從而增加了檢測和時間成本。
[0004] 因此，提供一種適用于從成分復雜的阿膠及其衍生產品中提取DNA的試劑盒是目 前亟待解決的問題，對于阿膠及其衍生產品的分子學鑒定具有十分重要的意義。

【發(fā)明內容】
陽0化]針對上述現(xiàn)有技術，本發(fā)明的目的是提供一種阿膠及其衍生產品高純度DNA的提 取試劑盒及其提取方法。
[0006] 為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術方案：
[0007] -種阿膠及其衍生產品高純度DNA的提取試劑盒，由組分I、組分II、蛋白酶K溶 液和RNA酶溶液組成；
[0008] 所述組分I的組成為：0. 08-0. 12M十二烷基硫酸鋼（SDS)，0. 8-1. 2MTris-HCl, 0. 4-0.SMNazEDTA,PH= 7. 5-8. 5 ;
[0009] 所述組分II的組成為：8. 0-8. 5MCsCl，8-12mMTris-肥 1，PH= 7. 5-8. 5。
[0010] 所述蛋白酶K溶液的濃度為15-25mg血I;優(yōu)選的，所述蛋白酶K溶液的濃度為 2OmgmL1。 陽0川所述RNA酶溶液的濃度為80-120mg血1;優(yōu)選的，所述RNA酶溶液的濃度為IOOmgmL1。RNA酶溶液的主要作用是降解殘存的RNA，進一步的提高DNA的純度；因此RNA 酶溶液的濃度需要適度，不宜過高或過低，過高會增加DNA提純的難度，過低則會使RNA降 解不徹底。 陽〇1引 優(yōu)選的，所述組分I的組成為：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0. 5M胞2邸TA,PH= 8. 0。 陽〇1引 優(yōu)選的，所述組分II的組成為：8. 3MCsCl,IOmMTris-HCl,PH= 8. 0。
[0014] 本發(fā)明還提供了采用該提取試劑盒從阿膠及其衍生產品中提取高純度DNA的方 法，步驟為：向待檢的阿膠或其衍生產品中加入提取試劑盒中的組分I、蛋白酶K溶液和RNA 酶溶液，經沉淀、分離得到DNA粗提物，阿膠或其衍生產品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶 液加入量的比為（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)血：（4-6)yL: (4-6)yL;
[0015] 向DNA粗提物中加入組分II溶解，250000-260000g離屯、28-3化，使組分II形成 連續(xù)的密度梯度，將溶解在組分II中DNA粗提物的DNA與雜質分離，即得到進一步提純的 DNA。
[0016] 上述提取高純度DNA的方法，具體步驟如下：
[0017] (1)向待檢的阿膠或其衍生產品中加入組分I、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液，混勻， 60-70°C水浴1-化，離屯、，取上清，得溶液A;阿膠或其衍生產品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA 酶溶液加入量的比為（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)mL: (4-6)yL: (4-6)yL; 陽0化]似向溶液A中加入化08-0. 12)倍體積的乙酸鐘溶液和（1. 5-2.W倍體積的乙 醇溶液，在液氮中放置4-6min，或（-80°C至-20°C)放置0. 5-比，離屯、，棄上清，得沉淀B;
[0019] 做向沉淀B中加入組分II溶解，用紫外分光光度計測定溶解后的溶液中DNA的 含量，按DNA:雙苯酷亞胺質量比=2:1加入雙苯酷亞胺染色，混勻，避光過夜，調節(jié)溶液折 射率為1. 3-1. 4,離心UV365nm下吸取DNA條帶，得溶液C;
[0020] (4)向溶液C中加入等體積異丙醇，混勻，分層后棄去上層溶液，重復此過程直至 在UV365nm下觀察不到巧光，再加入2-3倍體積80%乙醇，離屯、，棄去上清，洗涂沉淀，驚干 后加入(1地2〇溶解得到阿膠DNA溶液。
[0021] 步驟（2)中，所述乙酸鐘溶液的濃度為3mol/L，PH= 5. 2。 陽02引步驟（3)中，所述雙苯酷亞胺的濃度為0. 5mg血1。
[0023] 優(yōu)選的，步驟（1)中，阿膠或其衍生產品與組分I、蛋白酶K溶液、RNA酶溶液加入 量的比為 0). 5-1. :1 血：5yL:5yL。
[0024] 優(yōu)選的，步驟（I)中，水浴溫度為65°C，水浴時間為I.化；離屯、條件為：12000g離 屯、ISmin。 W巧]優(yōu)選的，步驟似中，放置的條件為：在液氮中放置5min，或-80°C放置0.化， 或-20°C放置比。上述放置操作的目的是使DNA粗提物析出，有利于下一步離屯、分離。
[0026] 優(yōu)選的，步驟似中，離屯、的條件為：12000g離屯、IOmin;離屯、的目的是沉淀、分離 DNA粗提物。
[0027] 優(yōu)選的，步驟（3)中，離屯、的條件為：254800g離屯、30h。該步驟中通過超高速長時 間離屯、可使得組分II形成連續(xù)的密度梯度，溶解在其中的DNA粗提物中的DNA與蛋白質、 鹽類小分子等雜質，因分子量大小不同會聚集在組分II中不同位置，有利于下一步高純度 分離DNA。
[0028] 本發(fā)明的有益效果：
[0029] (1)本發(fā)明的提取試劑盒特別適用于從成分復雜的阿膠及其衍生品中提取阿膠 的基因組DNA，針對阿膠及其衍生品中的蛋白成分高且黏度大、DNA含量少且高度降解的特 點，本發(fā)明的提取試劑盒首先用SDS將細胞膜裂解，在蛋白酶K、邸TA的存在下消化消化蛋 白質或多膚或小膚分子，核蛋白變性降解，使DNA從核蛋白中游離出來；在RNA酶存在下降 解殘存的RNA，進一步提高DNA純度；在超高速長時間離屯、時，組分II從液面到底部出現(xiàn)一 定的連續(xù)密度梯度，針對溶解在組分II中的DNA粗提取物的各種成分，比溶劑密度大的物 質會產生大分子沉降，比溶劑密度小的物質則會上浮，最后在重力和浮力平衡的位置聚集 形成大分子帶狀物，因此，利用DNA與蛋白質、鹽類小分子等雜質的分子量大小不同，DNA單 獨聚集在特定位置形成一條帶狀物，有利于DNA的高純度分離與純化。
[0030] (2)本發(fā)明的DNA提取試劑盒中的試劑來源廣泛，成本較低，降低了檢測的成本。 [00川做本發(fā)明的DNA提取方法未使用毒性和腐蝕性較大的酪、氯仿等有機試劑，提取 過程安全性好。
【附圖說明】 陽03引圖1為實施例1中DNA在提取試劑盒的組分II中的分布，圖中，A、B、C分別為阿 膠、阿膠糕和阿膠液；
[0033] 圖2為實施例2中用本發(fā)明提取試劑盒所得阿膠及其衍生產品DNA中驢源性成 分的實時巧光PCR擴增曲線；每次PCR設2次平行反應；圖中，1 :陽性對照，Ct平均值為 18. 98 ;2、3、4分別為實施例1中阿膠、阿膠糕和阿膠液的DNA擴增曲線，Ct平均值依次為 26. 01、26. 54、27. 18 ;5 :空白對照，無明顯擴增。
【具體實施方式】
[0034] 結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本 發(fā)明，并不對其內容進行限定。
[00對實施例1 :采用本發(fā)明的提取試劑盒提取阿膠及其衍生產品中的DNA
[0036] 1.提取試劑盒：
[0037]由組分I、組分II、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液組成；
[0038]組分I的組成為：0.IMSDS，1.OMTris-肥1,0.5MNazEDTA,PH= 8.0 ;