[0039]組分II的組成為：8. 3MCsCl,IOmMTris-HCl,PH= 8.0 ; W40] 蛋白酶K溶液的濃度為20mg血Srna酶溶液的濃度為IOOmg血1。 陽(yáng)OW 2.待檢測(cè)樣品：
[0042] 阿膠、阿膠糕和阿膠液；（均為市售產(chǎn)品）。 柳43] 3.提取方法： W44] (1)取待檢阿膠或阿膠糕1. Og或阿膠液1.0血放入2血離屯、管，每個(gè)樣品設(shè)置3 個(gè)重復(fù)，分別加入1血組分I，5yL蛋白酶K(終濃度為0.Img血1)，5yLRNA酶（終濃度 為0. 5mg血1)，充分混勻，65°C水浴1.化，12000g離屯、15min，分別取上清液（約600yL) 至新的2mL離屯、管中； W45] 似向離屯、管中加入60yL乙酸鐘溶液（3mol/L，PH= 5.。，1. 2血95 %乙 醇，-20°C放置比沉淀DNA，12000g離屯、lOmin，小屯、棄去上清，離屯、管底部有DNA粗制沉淀；
[0046] (3)將每個(gè)樣品DNA粗制沉淀合并在一個(gè)4血離屯、管中（目的為提高DNA最終 濃度），加入2mL組分II溶解DNA，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定DNA濃度分別為32ngyL1、 25〇邑^11、2811肖^11，分別按0臟：雙苯酷亞胺=2:1加入雙苯酷亞胺（0.5111肖血1)染色，混 勻，避光過(guò)夜，用IOmMTris-HCl調(diào)節(jié)溶液折射率為1. 3944左右，20°C254800g離屯、30h， UV365皿下拍照，結(jié)果如圖1，DNA在CsCl溶液中分別形成一條帶；
[0047] (4)用注射器小屯、吸取DNA至裝有40yL異丙醇管中，混勻，分層后棄上層溶液， 重復(fù)此過(guò)程直至在UV365nm下觀察不到巧光，每個(gè)樣品加入100yL80%乙醇，ieOOOg離 屯、20min，小屯、棄去上清，用70%乙醇洗涂沉淀，置于室溫5分鐘W徹底驚干DNA沉淀，加入 50yLd地2〇溶解DNA沉淀得到DNA溶液。
[0048] 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定所得阿膠及其衍生產(chǎn)品DNA溶液的濃度和純度，阿膠、 阿膠糕和阿膠液結(jié)果分別DNA濃度=42ngyL1，0D260/0D280 = 1. 712, 0D260/0D230 = 2. 110(阿膠）；DNA濃度=36ngyL1，0D260/0D280 = 1. 802, 0D260/0D230 = 2. 086(阿膠 糕）；DNA濃度=39ngyL1，0D260/0D280 = 1. 815, 0D260/0D230 = 2. 132 (阿膠液）；（用 水溶解DNA時(shí)會(huì)導(dǎo)致比值偏低，但并不表明DNA純度低，屬正?，F(xiàn)象），表明用本發(fā)明試劑盒 提取的DNA完全適用于下一步的分子生物學(xué)檢測(cè)。
[0049] 實(shí)施例2 :采用本發(fā)明的提取試劑盒所提取的阿膠及其附屬產(chǎn)品的DNA用于實(shí)時(shí) 巧光PCR對(duì)驢成分的檢測(cè)
[0050] 采用實(shí)時(shí)巧光PCR檢測(cè)實(shí)施例1所提阿膠及其附屬產(chǎn)品DNA中驢成分。
[0051] 引物和探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，稀釋成IOyM備用。
[0052] 驢成分特異性引物與探針采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)引物與探針（SN/T3730. 4-2013)，其序列 如下：
[0053] 上游引物尸:5'-44146(：1'口'46〇1^'4〔66口'44(：1'-3'；669 10^.1)
[0054] 下游引物1?:5'-〔4664144164416144144666押6-3'；（沈9 10^.2) 陽(yáng)化5]探針P:FAM-5'-TGCCGGACATCTTCTAATCCACCTT-3'-TAMRA。（沈QIDNO. 3)
[0056] 擴(kuò)增反應(yīng)體積為20yL包含2XPremixExTaq燈aKaRa) 10yL濃度為10yM的 上游引物F0.4yL濃度為IOyM的下游引物R0.4yL濃度為IOyM的探針P0.SyL RoxReferencedye0.4JiL, (1地2〇 6JiL,阿膠DNA2JiL。
[0057] 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95°C30s預(yù)變性；95°C5s，60°C30s，在60°C收集巧光信號(hào)，共計(jì)40 個(gè)循環(huán)。設(shè)置2次重復(fù)，同時(shí)設(shè)立無(wú)菌雙蒸水空白對(duì)照。
[0058] 結(jié)果：如圖2,陽(yáng)性對(duì)照Ct平均值為18. 98,空白對(duì)照無(wú)明顯擴(kuò)增，證明實(shí)時(shí)巧 光PCR擴(kuò)增體系正常；阿膠、阿膠糕及阿膠液樣品DNA中驢成分Ct平均值分別為26. 01、 26. 54、27. 18,均小于35,依據(jù)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)，結(jié)果判定為陽(yáng)性，表述為檢出驢性成分。
[0059] W上結(jié)果可W證明，本發(fā)明提供了一種可有效提取阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA 的試劑盒及其使用方法，所提DNA質(zhì)量高，適于進(jìn)一步的分子檢測(cè)。本試劑盒所用試劑少、 成本低、不使用有毒的苯酪/氯仿等易揮發(fā)的有機(jī)試劑，最大程度降低對(duì)人體的危害，可用 于阿膠及其衍生產(chǎn)品DNA的有效提取。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA的提取試劑盒，其特征在于，由組分I、組分II、蛋 白酶K溶液和RNA酶溶液組成； 所述組分I的組成為：〇. 08-0. 12M十二烷基硫酸鈉，0. 8-1. 2M Tris-HCl，0· 4-0. 6MNa2EDTA，PH = 7. 5-8. 5 ; 所述組分II的組成為：8.0-8. 5MCsCl，8-12mM Tris-HCl，PH = 7·5-8. 5。2. 如權(quán)利要求1所述的提取試劑盒，其特征在于，所述蛋白酶Κ溶液的濃度為 lS-SSmgmL1;所述RNA酶溶液的濃度為80_120mgmL^3.如權(quán)利要求1所述的提取試劑盒，其特征在于，所述組分I的組成為：0. 1M SDS，1. 0M Tris-HCl,0. 5M Na2EDTA, PH = 8. 0〇4. 如權(quán)利要求1所述的提取試劑盒，其特征在于，所述組分II的組成為：8. 3MCsCl， 10mMTris-HCl，PH= 8. 0。5. 采用權(quán)利要求1至4任一項(xiàng)所述的提取試劑盒從阿膠及其衍生產(chǎn)品中提取高純度 DNA的方法，其特征在于，步驟為：向待檢的阿膠或其衍生產(chǎn)品中加入提取試劑盒中的組分 I、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液，經(jīng)沉淀、分離得到DNA粗提物，阿膠或其衍生產(chǎn)品與組分I、 蛋白酶K溶液、RNA酶溶液加入量的比為（0. 5-1. 2)g: (0. 8-1. 2)mL: (4-6)μL: (4-6)μL; 向DNA粗提物中加入組分II溶解，250000-260000g離心28-32h，使組分II形成連續(xù) 的密度梯度，將溶解在組分II中DNA粗提物的DNA與雜質(zhì)分離，即得到進(jìn)一步提純的DNA。6. 如權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，具體步驟如下： (1) 向待檢的阿膠或其衍生產(chǎn)品中加入組分I、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液，混勻， 60-70°C水浴l_2h，離心，取上清，得溶液A; (2) 向溶液A中加入（0. 08-0. 12)倍體積的乙酸鉀溶液和（1. 5-2. 5)倍體積的乙醇溶 液，放置，離心，棄上清，得沉淀B; (3) 向沉淀B中加入組分II溶解，測(cè)定溶解后的溶液中DNA的含量，按DNA:雙苯酰亞 胺=2:1加入雙苯酰亞胺染色，混勻，避光過(guò)夜，調(diào)節(jié)溶液折射率為1. 3-1. 4,離心，吸取DNA 條帶，得溶液C; (4) 向溶液C中加入等體積異丙醇，混勻，分層后棄去上層溶液，重復(fù)此過(guò)程直至在 UV365nm下觀察不到熒光，再加入2-3倍體積的乙醇，離心，棄去上清，洗滌沉淀，晾干后加 入ddH20溶解得到阿膠DNA溶液。7. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（1)中，阿膠或其衍生產(chǎn)品與組分I、蛋 白酶K溶液、RNA酶溶液加入量的比為（0. 5-1. 2)g:lmL:5μL:5μL。8. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（2)中，放置的條件為：在液氮中放置 5min，或-80°C放置 0· 5h，或-20°C放置lh。9. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，所述雙苯酰亞胺的濃度為 0. 5mgmL10. 如權(quán)利要求6所述的方法，其特征在于，步驟（3)中，離心的條件為：254800g離心 30h〇
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種阿膠及其衍生產(chǎn)品高純度DNA的提取試劑盒，由組分I、組分II、蛋白酶K溶液和RNA酶溶液組成；所述組分I的組成為：0.08-0.12M？SDS，0.8-1.2M？Tris-HCl，0.4-0.6M？Na2EDTA，PH＝7.5-8.5；所述組分II的組成為：8.0-8.5M？CsCl，8-12mM？Tris-HCl，PH＝7.5-8.5。本發(fā)明還公開(kāi)了采用該試劑盒從阿膠及其衍生產(chǎn)品中提取高純度DNA的方法。本發(fā)明的試劑盒組分簡(jiǎn)單，試劑費(fèi)用低，能有效降低檢測(cè)成本。提取的DNA純度高，適于下一步的分子生物學(xué)檢測(cè)，提取過(guò)程中不使用酚/氯仿等有毒試劑，能降低危險(xiǎn)化學(xué)試劑對(duì)人體帶來(lái)的損害。
【IPC分類(lèi)】C12N15/10
【公開(kāi)號(hào)】CN105296470
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510854072
【發(fā)明人】張廣遠(yuǎn), 路興波, 孫紅煒, 李凡, 楊淑珂, 徐曉輝, 高瑞, 劉玲雪
【申請(qǐng)人】山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所
【公開(kāi)日】2016年2月3日
【申請(qǐng)日】2015年11月27日