羊源性成分鑒定及其制品中多物種種源成分的檢測(cè)試劑盒的制作方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及動(dòng)物分子生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及羊源性成分鑒定及其制品中多物種種 源成分的檢測(cè)試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002] 羊肉是我國(guó)人民食用的主要肉類(lèi)之一，既能御風(fēng)寒，又可補(bǔ)身體，是冬季的進(jìn)補(bǔ)佳 品。其肉質(zhì)與牛肉相似，但肉味較濃，味道鮮美。羊肉肉質(zhì)細(xì)嫩，含有豐富的蛋白質(zhì)，脂肪和 膽固醇較豬肉和牛肉少，礦物質(zhì)鈣、磷、鐵、鉀、碘等含量較豬牛肉高，營(yíng)養(yǎng)全面。李時(shí)珍在 《本草綱目》中說(shuō)："羊肉能暖中補(bǔ)虛，補(bǔ)中益氣，開(kāi)胃健身，益腎氣，養(yǎng)膽明目，治虛勞寒冷， 五勞七傷"，可見(jiàn)羊肉具有極高的食療價(jià)值。
[0003] 自2012年12331食品藥品安全熱線(xiàn)開(kāi)通以來(lái)，關(guān)注度逐年增加，而食品類(lèi)反映的 主要問(wèn)題是肉制品摻假，例如牛羊肉中摻入鴨肉、豬肉等。2013年江蘇無(wú)錫的"摻假羊肉" 事件，犯罪嫌疑人用狐貍、水貂、老鼠等未經(jīng)檢驗(yàn)檢疫的動(dòng)物肉制品冒充羊肉，流入了多家 知名火鍋店；亦或是成為羊肉串的成分。近年來(lái)，羊肉摻假事件常有發(fā)生，特別是接二連三 曝光的制售假羊肉案件，引發(fā)社會(huì)廣泛關(guān)注。羊肉摻假的方式一般是：摻雜豬肉、鴨肉、狐 貍?cè)獾绕渌麅r(jià)格較低的肉類(lèi)；或者直接用豬肉、鴨肉摻上羊油、香精、羊肉粉等。此外，在飼 料、皮張中摻假的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生；例如某些不法商販用相對(duì)廉價(jià)的豬皮冒充羊皮制品，欺 騙消費(fèi)者，從中牟取暴利。因此，針對(duì)羊源性制品建立一套科學(xué)、準(zhǔn)確、快速、低廉的檢測(cè)方 法是十分必要的。
[0004] 日常生活中人們通常依靠感官和經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行動(dòng)物產(chǎn)品鑒別，但是隨著加工方法的改 進(jìn)和各類(lèi)制品中摻假成分的多元化、種類(lèi)的復(fù)雜化，這種方法已遠(yuǎn)不能達(dá)到對(duì)動(dòng)物源性制 品摻假現(xiàn)象進(jìn)行控制與監(jiān)管的目的。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)的發(fā)展，以聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR) 為基礎(chǔ)的技術(shù)已成為動(dòng)物源性成分鑒定的核心方法。同時(shí)，DNA也因其高穩(wěn)定性和在不同組 織中的同一性被選作比蛋白質(zhì)更可靠的分析靶點(diǎn)。目前，根據(jù)線(xiàn)粒體基因組DNA序列差異設(shè) 計(jì)物種特異性引物所建立的PCR方法已有大量報(bào)道（GhovvatiS，NassiriMR，Mirhoseini SZ,HeraviMA,JavadmaneshA.Fraudidentificationinindustrialmeatproductsby multiplexPCRassay.FoodControl, 2009, 20(8) :696-699；GirishPS,AnjaneyuluAS R,ViswasKN,ShivakumarBM,AnandM,PatelM,SharmaB.Meatspeciesidentification bypolymerasechainreaction-restrictionfragmentlengthpolymorphism(PCR-RFLP) ofmitochondrial12SrRNAgene.MeatScience,2005,70(1):107-112；DooleyJ J，PaineKE，GarrettSD,BrownΗM.DetectionofmeatspeciesusingTaqMan real-timePCRassays.MeatScience，2004, 68 (3): 431-438·)，且被列入了 中國(guó)權(quán)威的檢 測(cè)技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)（步迅，張全芳，劉艷艷.一種同時(shí)鑒定山羊、綿羊、豬和鴨肉源性的熒光標(biāo)記基 因復(fù)合擴(kuò)增方法[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN103397101A，2013-11-20 ;張英杰，劉月琴，陳睿賾，劉彥 琴，郭云霞，李雪梅，楊佳棟，錫建中.一次性鑒別羊肉、雞肉、鴨肉、豬肉的PCR檢測(cè)方法及 試劑盒[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN104099405A，2014-10-15.)。但是線(xiàn)粒體DNA拷貝數(shù)多，在不同組 織中含量不同，穩(wěn)定性差且難以進(jìn)行定量分析。而動(dòng)物細(xì)胞核基因組DNA序列具有高度的 物種特異性，能夠避免非特異性擴(kuò)增，更加適合用作PCR定性和定量分析。目前，國(guó)際上以 細(xì)胞核DNA序列為目標(biāo)序列，用于鑒別肉源的PCR檢測(cè)方法大多只能區(qū)分開(kāi)牛、羊、豬、雞、 鴨等常見(jiàn)肉制品（黃明，程欣，楊靜，黃繼超，周興虎.一種快速檢測(cè)血旺中雞鴨豬血液成分 的方法[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN103525908A，2014-01-22 ;黃明，黃瑋玲，楊靜，徐幸蓮，周光宏.一 種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法[P]，中 國(guó)專(zhuān)利：CN102864243B，2013-9-25)。而肉產(chǎn)品市場(chǎng)摻假的復(fù)雜性（例如，我國(guó)多地的"混 合羊肉"事件中有不法分子將狐貍、水貂、老鼠等動(dòng)物肉，添加進(jìn)羊肉里銷(xiāo)往江蘇、上海等地 的農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；歐洲"馬肉風(fēng)波"以馬肉冒充高檔牛肉等）表明，一種更加快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、全 面的肉類(lèi)摻假的檢測(cè)方法成為當(dāng)今市場(chǎng)最為迫切的需求，而目前能用于同時(shí)鑒別馬、狐貍、 水貂、鼠等多種動(dòng)物種源性成分的PCR檢測(cè)方法尚未見(jiàn)報(bào)道。此外，在飼料、皮張中動(dòng)物源 性成分摻假的現(xiàn)象也時(shí)有發(fā)生。因此，建立用于鑒別多物種的快速檢測(cè)方法將對(duì)食品安全 的監(jiān)管具有重要的實(shí)踐意義。
[0005] 此外，就檢測(cè)方法而言，目前多采用熒光PCR檢測(cè)（曹琛福，宗卉，張彩虹等.驢 或驢源性成分實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法及檢測(cè)用引物和探針[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN102311999A， 2012-1-11 ;黃明，黃瑋玲，楊靜，徐幸蓮，周光宏.一種添加擴(kuò)增內(nèi)標(biāo)的食品中豬肉或雞肉 成分Taqman探針熒光定量PCR快速檢測(cè)方法[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN102864243B，2013-9-25)、 酶切檢測(cè)（章安，尤金花，解福生，師秀梅.一種鑒定動(dòng)物皮張的方法[P]，中國(guó)專(zhuān)利： CN1294277C，2007-1-10 ;姚永剛，陳仕毅，劉益平.一種快速鑒別5種家畜肉和肉干制品種 類(lèi)的方法[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN101712996,2010-5-26)或者通過(guò)擴(kuò)增片段大?。▎探ㄜ姡瑢O艷 華，張智禹，關(guān)叢笑.多重PCR檢測(cè)食品中肉類(lèi)來(lái)源的引物組及試劑盒[P]，中國(guó)專(zhuān)利：CN 101962675B，2013-2-6)等來(lái)進(jìn)行判斷。但是熒光檢測(cè)方法對(duì)設(shè)備的要求高且花費(fèi)較大； 酶切檢測(cè)方法則費(fèi)時(shí)費(fèi)力；而多重PCR通過(guò)擴(kuò)增片段大小來(lái)鑒別動(dòng)物肉源嚴(yán)重限制了可檢 測(cè)物種的數(shù)量，且引物間常相互干擾或形成二聚體，影響檢測(cè)結(jié)果的可信度。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，提供一種可用于羊源性制品特異性檢測(cè)的 引物；
[0007] 本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供用于羊源性制品檢測(cè)的檢測(cè)試劑盒；
[0008] 本發(fā)明的目的還在于提供羊源性制品摻假鑒定方法。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明從種內(nèi)一致性和穩(wěn)定性、種間特異性、拷貝數(shù)等方面進(jìn)行 羊基因組特異DNA序列的篩選，經(jīng)過(guò)?？品茄騺喛频呐！⑺?，非?？频呢i、馬、驢、鼠（大 鼠、小鼠、倉(cāng)鼠）、豚鼠、雞、鴨、鵝、兔、狗、狐和水貂等的基因組DNA及不同的羊品種DNA中的 檢測(cè)，篩選在羊中特異的、在其他物種中不存在或同源性低的DNA片段作為檢測(cè)分子。經(jīng)過(guò) 大量分析和實(shí)驗(yàn)工作，最終獲得可供檢測(cè)使用的特異DNA序列，其核苷酸序列如序列表SEQ IDNo. 1 所示。
[0010] 基于此，本發(fā)明首先提供一種羊特異性引物，其特異性擴(kuò)增SEQIDNo. 1所示的核 苷酸序列或該序列的特異性片段。
[0011] 優(yōu)選地，引物長(zhǎng)度為18~27bp。引物的設(shè)計(jì)需要考慮是否容易發(fā)生錯(cuò)配、擴(kuò)增片 段長(zhǎng)度、反應(yīng)溫度等多方面。
[0012] 優(yōu)選地，該引物序列如下：
[0013] 0VIS-F-.5'-AGGTTCCAGCCTCACCAGTGA-3r
[0014]OVIS-R： 5r -ACTGCTTGTGTCTCTGATGCCA-3r ；
[0015] 或該引物向Y、3<端延伸或修飾得到的仍能特異性擴(kuò)增SEQIDNo.1所示序列 的引物。
[0016] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供含有上述特異性引物的檢測(cè)試劑盒。
[0017] 優(yōu)選地，所述試劑盒還進(jìn)一步包括以下引物中的一種或多種：
[0018] (1)對(duì)豬基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成豬特異性擴(kuò)增片段的引物對(duì)I:
[0019]SUS-F: 5' -GCAATGCTCCAAGGACTTAGTGA-3'
[0020] SUS-R： 5r -TGTGCTCAAATAGGAAGGTTGTCA-3r ；
[0021] (2)對(duì)普通?；蚪MDNA進(jìn)行擴(kuò)增生成牛特異性擴(kuò)增片段的引物對(duì)Π:
[0022]B0S-F：5r -CAGTGAGGACATCAGCCTAGAGT-3r
[0023] BOS-R：5r -CTGCTCCTAGCCATCAGTGGA-3r ；
[0024] (3)對(duì)水?；蚪MDNA進(jìn)行擴(kuò)增生成水牛特異性擴(kuò)增片段的引物對(duì)III:
[0025]BUBALUS-F:5, -GAAGAAGAGGGAGGGGTAGACAA-3,
[0026] BUBALUS-R：5r -CAGAACTAGTGAAGGCGGCA-3r；
[0027] (4)對(duì)馬屬（馬、驢）基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成馬屬特異性擴(kuò)增片段的引物對(duì)IV:
[0028]EQUUS-F： 5r -TGGCTCTGAAGATGATGAGGCTG-3r
[0029]EQUUS-R： 5r -GAGGCAATGATTTTGTTCTGCGT-3r ；
[0030] (5)對(duì)兔基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成兔特異性擴(kuò)增片段的引物對(duì)V:
[0031] 0CU-F: 5' -TAGCAGTAGGGATGACAGGGTTT-3，
[0032]OCU-Rj' -GCCTTAGAGTAG