GGTCTTTTTGG-S';
[0033] (6)對狐基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成狐特異性擴(kuò)增片段的引物對VI:
[0034]VULPES-F:5' -ACAGGGGAGAAAACGCTGTTC-3'
[0035]VULPES-R:5' '-GGCCTCCCCGAGATGAATC-3';
[0036] (7)對狗基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成狗特異性擴(kuò)增片段的引物對W:
[0037]CANIS-F-.5'-GCGGCAAAGTTAACGGCAGT-3'
[0038]CANIS-R:5, -GGATGGGAAGCAAACTCCGA-3,;
[0039] (8)對水貂基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成貂特異性擴(kuò)增片段的引物對W:
[0040]MUSTLA-F:5' -TTCGGCGCTGCCTTAATTGTC-3，
[0041]MUSTLA-R-.5'' -AAGACCTGGGACCCGAGAGTT-3r ；
[0042] (9)對鼠（小鼠、大鼠、倉鼠）基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成鼠特異性擴(kuò)增片段的引物 對IX:
[0043]MUS_RAT_CRI-F： 5r -CATCGTTGACAAGAAGGTGCTC-3r
[0044]MUS_RAT_CRI-R:5' -GAAAAAGCTGTACTTGGTGGGG-3';
[0045] (10)對雞基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成雞特異性擴(kuò)增片段的引物對X:
[0046]GALLUS-F: 5' '-GCAAGGAGATGTAACCCAGTAAAG-3，
[0047]GALLUS-R： 5r -AGAATCAATCAGAAAAATGAAGCC-3r ；
[0048] (11)對鴨基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增生成鴨特異性擴(kuò)增片段的引物對XI :
[0049]ANAS-F:5' '-GTCAACGATTGCCCCGAAAC-3，
[0050]ANAS-R:5，'-GGGGACTTTGACGGCATCTT-3'。
[0051] 優(yōu)選地，所述試劑盒還包括下述試劑中的一種或多種：Taq酶、dNTPs、MgCl2、 PCR緩沖液、陽性對照DNA模板、雙蒸水；或者還包括下述試劑中的一種或多種：TaqDNA MasterMix、陽性對照DNA模板、雙蒸水。
[0052] 所述陽性對照DNA模板為?？蒲騺喛频纳窖蚝途d羊基因組DNA模板；
[0053] 優(yōu)選地，所述陽性對照DNA模板還包括豬、普通牛、水牛、馬、驢、兔、狐、狗、水貂、 小鼠、大鼠、倉鼠、雞、鴨DNA模板中的一種或多種。
[0054] 進(jìn)一步，本發(fā)明提供上述的羊特異性引物或檢測試劑盒在羊源性成分鑒定或羊源 性制品摻假檢測中的應(yīng)用。
[0055] 本發(fā)明還提供一種羊源性成分鑒定及其制品中多物種種源成分的PCR檢測方法， 其步驟如下所述：
[0056] 1)提取樣品基因組DNA;
[0057] 2)PCR檢測：
[0058] A)用所述的羊特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以羊基因組DNA模板為陽性對照，以雙 蒸水為空白對照；
[0059] B)用所述的試劑盒，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并以羊基因組DNA模板、豬、牛、水牛、馬屬、兔、 狐、狗、水貂、鼠、雞或鴨DNA模板中的一種或多種為陽性對照，以雙蒸水為空白對照；
[0060] 3)對PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測和結(jié)果判定。
[0061] 優(yōu)選地，其中步驟2)PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系如下：
[0062] 表1本發(fā)明PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系
[0063]
[0064] 所述的PCR反應(yīng)程序如下：
[0065] 95°C預(yù)變性 5min;95°C變性 30s，62°C退火 30s，72°C延伸 158,30次循環(huán)；4°(：降溫 2min；
[0066] 結(jié)果判定方法是：當(dāng)PCR反應(yīng)產(chǎn)物與陽性對照擴(kuò)增產(chǎn)物相符，且空白對照無擴(kuò)增 產(chǎn)物時，判定樣品中檢測出羊源性成分；當(dāng)PCR反應(yīng)產(chǎn)物無擴(kuò)增產(chǎn)物或與陽性對照擴(kuò)增產(chǎn) 物不符，且空白對照無擴(kuò)增產(chǎn)物時，判定樣品中未檢測出羊源性成分；如果陽性樣品未檢測 出預(yù)期片段，說明試劑失效或操作失誤；若空白對照與陽性樣品均檢出，說明試劑污染或操 作失誤。
[0067] 對于摻假的檢查方法是以上述豬、普通牛、水牛、馬屬、兔、狐、狗、水貂、鼠、雞、鴨 引物對I~XI擴(kuò)增待檢樣品DNA，檢測是否存在對應(yīng)的擴(kuò)增產(chǎn)物，并判斷是否存在相應(yīng)成 分，判斷方式同上。
[0068] 本發(fā)明中檢測結(jié)果可用瓊脂糖凝膠電泳呈現(xiàn)，也可用測序或其他有效方法檢測； 提取樣品DNA的方法可用苯酚-氯仿提取法，也可使用公認(rèn)的、具有相同效力的其他提取方 法。
[0069] 本發(fā)明提供了有效的、精準(zhǔn)的、可靠的羊源性成分鑒定或羊源性制品摻假檢測的 方法，所組裝的試劑盒能快速鑒定樣品中是否含有羊源性成分，并可根據(jù)PCR產(chǎn)物鑒別綿 羊和山羊，以及是否摻有豬、普通牛、水牛、馬屬、兔、狐、狗、水貂、鼠、雞、鴨等動物成分。本 發(fā)明的方法可以在肉品、飼料和皮張檢測中作為標(biāo)準(zhǔn)檢測方法使用。本發(fā)明試劑盒及檢測 方法具有簡便、快速、全面、特異性強(qiáng)的特點(diǎn)，且成本較低，適用性廣。
【附圖說明】
[0070] 圖1 :是SEQIDNo. 1所示的特異序列在羊中具有物種特異性的檢測結(jié)果。以豬、 牛（普通牛、7K牛）、羊（綿羊、山羊）、馬、驢、鼠（大鼠、小鼠、倉鼠）、豚鼠、雞、鴨、鸛、兔、狗、 狐、水貂和貉子的DNA為模板，擴(kuò)增所述特異片段，所有測試樣品中僅在羊（綿羊和山羊） 中得到擴(kuò)增產(chǎn)物，非羊樣品中均無擴(kuò)增產(chǎn)物，且在綿羊中有2條擴(kuò)增條帶，山羊中僅有1條 擴(kuò)增條帶。結(jié)果表明所擴(kuò)增片段在羊中具有特異性，且可有效區(qū)分綿羊和山羊。泳道中編 號說明如下：Μ:為BM2000DNAMarker;1-3 :空白對照；4-6 :綿羊；7-9 :山羊；10-12 :小鼠； 13-15 :大鼠；16-18 :倉鼠；19-21 :豚鼠；22-24 :普通牛；25-27 :水牛；28-30 :豬；31-33 : 馬；34-36 :驢；37-39 :雞；40-42 :鴨；43-45 :鵝；46-48 :兔；49-51 :狐；52-54 :狗；55-57 : 水貂；58-60 :貉子。
[0071] 圖2:是SEQIDNo. 1所示的特異序列在羊不同DNA模板濃度中的靈敏度檢測結(jié) 果。分別以〇· 1即/以1^、11^/^1^、1〇1^/^1^、100即/^1^的綿羊、山羊0嫩為模板，擴(kuò)增所述特 異片段，0.lng/μL的模板濃度即有擴(kuò)增，表明特異性引物所擴(kuò)增片段具有較好的靈敏性。 泳道中編號說明如下：Μ:為ΒΜ2000DNAMarker;1-4 :空白對照；5-8 :0.Ing/yL的模板濃 度；9-12 :lng/μL的模板濃度；13-16 :10ng/μL的模板濃度；17-20 :100ng/μL的模板濃 度。
[0072] 圖3 :是SEQIDNo. 1所示的特異性序列在綿羊、山羊不同品種的多個體中的保守 性檢測結(jié)果。以湖羊、杜泊羊、小尾寒羊、南非美利奴羊等綿羊品種的DNA為模板，擴(kuò)增所述 特異片段，所有綿羊中有2條擴(kuò)增條帶；以麻城黑山羊、內(nèi)蒙古絨山羊等山羊品種的DNA為 模板，擴(kuò)增所述特異片段，所有山羊中僅有1條擴(kuò)增條帶。表明所擴(kuò)增片段在綿羊不同品 種、山羊不同品種中分別具有保守性。如圖：A是30個綿羊個體保守性檢測結(jié)果；B是30個 山羊個體保守性檢測結(jié)果。
[0073] 圖4:是普通牛、水牛、馬屬（馬、驢）、鼠（大鼠、小鼠、倉鼠）、豬、雞、鴨、兔、狗、狐 和水貂的各特異性引物所擴(kuò)增的特異序列在本物種中具有物種特異性的檢測結(jié)果。采用上 述引物對I~XI，以豬、普通牛、水牛、羊（綿羊、山羊）、馬、驢、鼠（大鼠、小鼠、倉鼠）、豚 鼠、雞、鴨、鵝、兔、狗、狐、水貂和貉子的DNA為模板，擴(kuò)增上述各物種的特異片段，所有引物 僅在本物種中得到擴(kuò)增產(chǎn)物，在非本物種樣品中均無擴(kuò)增產(chǎn)物。結(jié)果表明各物種引物以及 所擴(kuò)增片段具有物種特異性。如圖：A:普通牛特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；B:水牛特異性引物擴(kuò) 增結(jié)果；C:馬屬（馬和驢）特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；D:鼠（大鼠、小鼠、倉鼠）特異性引物擴(kuò)增 結(jié)果；E:豬特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；F:雞特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；G:鴨特異性引物擴(kuò)增結(jié)果； Η:兔特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；I:狗特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；J:狐特異性引物擴(kuò)增結(jié)果；K:水貂 特異性引物擴(kuò)增結(jié)果。
[0074] 圖5 :是所組裝的試劑盒對市場中羊肉制品摻假產(chǎn)品的檢測結(jié)果。用本發(fā)明的試 劑盒對市場中獲取的21組樣品進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)有5組產(chǎn)品為鴨肉摻假產(chǎn)品。泳道中編號 說明如下：Μ:為ΒΜ2000DNAMarker;Ε:空白對照；Υ:羊陽性對照；Ya:鴨陽性對照；1-5 :羊 肉產(chǎn)品中檢出鴨源性成分摻假。
【具體實(shí)施方式】
[0075] 以下實(shí)施例用于進(jìn)一步說明本發(fā)明，但不應(yīng)理解為對本發(fā)明的限制，在不背離本 發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的前提下，對本發(fā)明所做的修改或潤色均屬于本發(fā)明的范圍。
[0076] 實(shí)施例1樣品中羊源性成分特異性檢測
[0077] 1.試樣的制備與保存
[0078] 1. 1 取樣
[0079] 采集羊肉樣品lg，于-20°C下保存?zhèn)溆谩?br>[0080] 1.2DNA模板制備
[0081] DNA模板制備采用常用的苯酚-氯仿粗提法（薩姆布魯克J，弗里奇EF，曼尼阿蒂 斯T.分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M].第2版.金冬雁，黎孟楓.北京：科學(xué)出版社，1999. 465-467) 或者公認(rèn)的、具有相同效力的其他提取方法，這些方法都是報(bào)道的常用方法。