大熊貓抗病毒潛力檢測的i類mhc基因的特異性引物及分型方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及用于擴增大熊貓I類主要組織相容性復(fù)合體（major histocompatibility complex，MHC)基因二號及三號外顯子的特異性引物，尤其涉及大熊 貓抗病毒潛力檢測的I類MHC基因的特異性引物及分型方法。
【背景技術(shù)】
[0002] 大熊貓（Ailuropoda melanoleuca)是國家一級保護動物，在2008年已被《世界自 然保護聯(lián)盟》（IUCN)列入瀕危物種紅色名錄，同時大熊貓也是世界自然基金會的形象大使 和世界生物多樣性保護的旗艦物種。由于以竹子為主食的大熊貓雖仍保留著食肉動物的牙 齒和消化道特征，其漫長的演化過程和成功存活的原因也備受科學(xué)界關(guān)注。被譽為"國寶" 的大熊貓在距今60萬年前曾廣泛分布于我國東南黃河、長江和珠江流域，然而現(xiàn)代農(nóng)林業(yè) 的發(fā)展破壞了大熊貓的棲息地，使它們的分布縮小到四川、陜西和甘肅三省毗鄰的高山峽 谷中。如今大熊貓種群彼此孤立在秦嶺、岷山、邛崍上、大相嶺、小相嶺和涼山六個山系。
[0003] -系列保護遺傳學(xué)研究采用分子技術(shù)利用中性標記（如線粒體DNA控制區(qū)、指紋 圖譜和微衛(wèi)星標記等）來了解不同山系間大熊貓種群的遺傳多樣性和種群分化模式，發(fā)現(xiàn) 棲息地的破壞使得大熊貓產(chǎn)生近交，對于像大熊貓這樣的小種群來說近交帶來的近交衰退 和遺傳負荷會使物種群體適應(yīng)度下降最終導(dǎo)致滅絕。這些研究雖然為設(shè)計大熊貓保護育種 方案提供了幫助，但并未反映出大熊貓在種群演化過程中的適應(yīng)性能力，而這一重要信息 是建立全面保育方案不可或缺的部分。另外，如今高疾病感染率和高死亡率嚴重威脅著大 熊貓的生存。因為主要組織相容性復(fù)合體（MHC)具有結(jié)合及呈遞抗原從而激發(fā)相應(yīng)免疫反 應(yīng)的功能，所以其在面對多變的病原時展現(xiàn)的適應(yīng)性進化是評估一個物種適應(yīng)性能力的標 記。因此深入研究大熊貓的MHC基因家族，能幫助我們評估大熊貓的適應(yīng)性能力和進一步 了解其高染病率的成因。
[0004] I類MHC基因編碼豐富的細胞表面蛋白，這些蛋白位于機體內(nèi)所有有核細胞表面。 當細胞遭病毒侵入，病毒碎片將透過I類MHC提示在該細胞外側(cè)供殺手T細胞等辨識，從而 開啟被感染細胞和其中病毒的清除過程。由此可見，機體對病毒的易感性和自身免疫能力 等多種生物學(xué)特征都將受I類MHC基因的基因型、表達多樣性及表達豐度影響。經(jīng)典I類 MHC結(jié)合病毒抗原肽部位由基因二號和三號外顯子編碼，研究這兩個位點的遺傳變異和山 系分化有助于我們探究與大熊貓疾病有關(guān)的I類MHC等位基因和了解該物種的抗病毒感染 能力強弱。然而，由于MHC基因是多基因家族，基因復(fù)制和協(xié)同進化使同一座位上的不同等 位基因差異較大，在用通用引物進行多位點擴增時可能無法擴增所有等位基因?qū)е聼o效等 位基因產(chǎn)生，而不同座位之間的等位基因又高度相似，通用引物會交叉擴增不同座位等位 基因。另外，研究關(guān)注有功能的MHC基因，而大量不表達的MHC假基因會成為干擾數(shù)據(jù)。因 此，在正確分離和鑒定大熊貓所有表達的I類MHC基因的基礎(chǔ)上，設(shè)計座位特異引物并正確 進行大熊貓I類MHC基因分型和基因多態(tài)性分析是研究與病毒引起的疾病有關(guān)的特定等位 基因和評估大熊貓抗病能力的必要前提，對大熊貓保育計劃設(shè)計有重要借鑒意義，比如野 外放歸時選擇適應(yīng)能力強的個體和選擇優(yōu)良個體進行人工配種。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供大熊貓I類MHC區(qū)域4個經(jīng)典座位（Aime-C、Aime-F、Aime-I及 Aime-L)二號和三號外顯子擴增的特異性引物及分型方法，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
[0006] 用于擴增大熊貓I類MHC區(qū)域Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號及三號 外顯子的特異性引物組包括十一對引物對，所述引物對的核苷酸序列如下所示：
[0007] 引物對一：上游引物 yyE2Bl: TCAGCCCCTCCGCGCCCGCAG (如 SEQ ID NO: 1 所示）；
[0008] 下游引物 yyE2B2:GACCCGGGCCGCGTCGCTCAC (如 SEQ ID N0:2 所示）；
[0009] 引物對二：上游引物1611H2F:ATGACGTATTTCTACACCGGC(如SEQIDN0:3所示） ；
[0010] 下游引物 1R:TCCATTTTCCCTTCCTGGTGGG (如 SEQ ID N0:4 所示）；
[0011] 引物對三：上游引物 152E2A3:GCCCTGCTCTCCCCCACTCAG (如 SEQ ID N0:5 所示）；
[0012] 下游引物 152E2A4:CGGGGGTTCCTGAGAGTTGGGGC (如 SEQ ID N0:6 所示）；
[0013] 引物對四：上游引物 152E3A1:AGTCCGAGCGTTGCCCCAACTCTC (如 SEQ ID N0:7 所 示）；
[0014] 下游引物 152E3A2:AGTAATGGCCCTGAGTAAGGTTTC (如 SEQ ID N0:8 所示）；
[0015] 引物對五：上游引物 128E22F:CCTGCTCTCCCCAACGCG (如 SEQ ID N0:9 所示）；
[0016] 下游引物 128E22R:GTCACAGCCGTGCATCCA(如 SEQ ID NO: 10 所示）；
[0017] 引物對六：上游引物 128E3 IF: CCGAGTGGACTTGCAGACCGCC (如 SEQ ID NO: 11 所 示）；
[0018] 下游引物 128E32R:GTCCGGGGTTTCTGAAGAAGAACG (如 SEQ ID N0:12 所示）；
[0019] 引物對七：上游引物 1300E22F: GGGAGAAGGGTCGGGCGGGAC (如 SEQ ID NO: 13 所 示）；
[0020] 下游引物 1300E21R:AGGTCACAGCCGTGCATCTC(如 SEQ ID N0:14 所示）；
[0021] 引物對八：上游引物 1300E32F:GCTCTCACACCATCCAGGA(如 SEQ ID NO: 15 所示）；
[0022] 下游引物 l3〇OE3lR:GTCGGGGGTTTCTGAAGAAGAATC(如 SEQ ID NO: I6 所示）；
[0023] 引物對九：上游引物 yySE23F:CGCCCGCAGGCTCGCACTCC(如 SEQ ID NO: 17 所示）；
[0024] 下游引物 yySE22R:GCAGGATGTTCAGGCTCT (如 SEQ ID NO: I8 所示）；
[0025] 引物對十：上游引物 152E3B1:TCGCCTCCTGTCGGGCGGGGCCAG (如 SEQ ID N0:19 所 示）；
[0026] 下游引物 152E3B2:AGCCAGCCCCAGCGGAGGGG (如 SEQ ID NO:2〇 所示）；
[0027] 引物對十一：上游引物 1300E32F: GCTCTCACACCATCCAGGA (如 SEQ ID NO: 15 所 示）；
[0028] 下游引物 152E3B2:AGCCAGCCCCAGCGGAGGGG (如 SEQ ID NO:2〇 所示）；
[0029] 其中，引物對一、引物對三、引物對五及引物對七分別為Aime-C、Aime-F、Aime-I 及Aime-L二號外顯子巢式PCR外側(cè)引物；引物對九為Aime-C二號外顯子巢式PCR內(nèi)側(cè)引 物，而引物對一為Aime-F、Aime-I及Aime-L二號外顯子共同的巢式PCR內(nèi)側(cè)引物；引物 對二、引物對四、引物對六及引物對八分別為Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L三號外顯 子巢式PCR外側(cè)引物；引物對^ 為Aime-L二號外顯子巢式PCR內(nèi)側(cè)引物，而引物對十為 Aime-F、Aime-I及Aime-C三號外顯子共同的巢式PCR內(nèi)側(cè)引物。
[0030] 一種大熊貓I類MHC區(qū)域Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號及三號外 顯子的分型方法是采用所述的引物，以從大熊貓糞便中用酚氯仿法提取的DNA為模板，每 對引物分別進行巢式PCR擴增，第一輪巢式PCR用10yL體系，第二輪巢式PCR用30yL體 系，在特定PCR擴增條件下進行目標片斷擴增，然后將擴增產(chǎn)物利用SSCP對每個位點分別 進行基因分型。
[0031] 擴增大熊貓Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號及三號外顯子的第一輪 PCR 10yL PCR 體系是：5yL 2x GC Buffer，0.8yL 2.5mM 的dNTP，0.3yL 10mM 的第一輪 巢式PCR上游引物，0. 3yL lOmM的第一輪巢式PCR下游引物，0. lyL 5U/yL的Ex-Taq酶， lμL基因組DNA，2·5μL滅菌超純水；第二輪PCR30μL體系是：3μL10xEχ-TaqBuffer， 2.4yL 2.5mM的dNTP，0.9yL 10mM的第二輪巢式PCR上游引物，0.9yL 10mM的第二輪巢 式PCR下游引物，0. 3yL 5U/yL的Ex-Taq酶，1 yL第一輪PCR產(chǎn)物，21. 5yL滅菌超純水。
[0032] 擴增大熊貓Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號外顯子的第一輪PCR擴增 條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，退火30秒，此處擴增Aime-C、A