ime-F、Aime-I 及Aime-L二號(hào)外顯子退火溫度依次為：67.8°C、65. 3°C、63. 5°C和62. 5°C，72°C延伸60秒， 但擴(kuò)增Aime-C二號(hào)外顯子延伸30秒，共22個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘；第二輪PCR擴(kuò) 增條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，67. 8°C退火30秒，但擴(kuò)增Aime-C二號(hào)外顯 子退火溫度為61°C，72°C延伸30秒，共31個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘。
[0033] 擴(kuò)增大熊貓Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因三號(hào)外顯子的第一輪PCR擴(kuò) 增條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，退火30秒，擴(kuò)增Aime-C、Aime-F、Aime-I及 Aime-L三號(hào)外顯子退火溫度依次為：62. 5°C、59. 5°C、63. 5°C和62. 5°C，72°C延伸60秒，共 22個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘；第二輪PCR擴(kuò)增條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30 秒，67. 8°C退火30秒，但擴(kuò)增Aime-L三號(hào)外顯子退火溫度為64°C，72°C延伸30秒，共31個(gè) 循環(huán)，最后72 °C延伸5分鐘。
[0034] 對大熊貓I類MHC區(qū)域上述基因二號(hào)外顯子和三號(hào)外顯子進(jìn)行SSCP分型的方法 是：
[0035] 1)用玻璃洗滌劑清洗大小玻璃板，瀝水后用酒精棉擦拭3次，并待酒精揮發(fā)后裝 板，將間隔條置于大小玻璃板間，并用專用架將兩邊夾緊，固定于模具上；
[0036] 2)制備12%的非變性聚丙烯酰胺凝膠膠液，將膠液混勻后慢慢注入大小玻璃板 間，確認(rèn)無氣泡存在后插入梳子，常溫平置；
[0037] 3)待膠凝固后，從模具上卸下并架于電泳裝置上，用瓊脂糖封膠；取下梳子，并用 裝滿0. 5XTBE的注射器沖洗點(diǎn)樣孔；放入電泳槽中，倒入0. 5XTBE，預(yù)電泳20min ;
[0038] 4)樣品電泳，吸取8uL PCR產(chǎn)物，加入4uL 2 X loading buffer，快速離心混合， 95°C變性7min后迅速置于冰上，并用槍及時(shí)加入點(diǎn)樣孔內(nèi)，4°C，30W，電泳8-llh ;
[0039] 5)將膠從玻璃板間卸下，加入500mL固定液，于搖床上固定30min，倒掉固定液，倒 入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0040] 6)加入500mL銀染液，于搖床上銀染30min，倒掉銀染液，使用500mL雙蒸水迅速 洗膠4次；
[0041] 7)加入500mL預(yù)冷的顯影液，于搖床顯影，等待條帶清晰后倒去顯影液，加入 500mL固定液終止顯影，倒掉固定液，倒入500mL雙蒸水洗膠4次；
[0042] 8)讀取條帶，確定基因型。
[0043] 本發(fā)明根據(jù)構(gòu)建好的I類MHC基因物理圖譜分離得到的大熊貓所有表達(dá)的MHC基 因設(shè)計(jì)出大熊貓I類MHC區(qū)域4個(gè)經(jīng)典座位二號(hào)和三號(hào)外顯子的特異引物。MHC基因是多 基因家族，基因復(fù)制和協(xié)同進(jìn)化使同一座位上的不同等位基因差異較大，而不同座位之間 的等位基因又高度相似。本發(fā)明設(shè)計(jì)的特異擴(kuò)增引物和分型方法較過去通用引物在大熊貓 I類MHC基因分型上有較大優(yōu)勢，具體表現(xiàn)為：1.對大熊貓是無損傷的。由于本發(fā)明能通過 巢式PCR有效擴(kuò)增糞便樣品中提取的DNA，所以優(yōu)于抽血提取DNA等可能會(huì)對大熊貓?jiān)斐蓚?害的取樣方法；2.巢式PCR特異性高，擴(kuò)增效果更好。采用本發(fā)明的引物運(yùn)用巢式PCR可 以在有效擴(kuò)增同一座位上不同等位基因的同時(shí)避免產(chǎn)生無效等位基因，而且不會(huì)交叉擴(kuò)增 不同座位的等位基因。利用本發(fā)明有利于正確進(jìn)行大熊貓I類MHC基因分型和基因多態(tài)性 分析，能幫助我們進(jìn)一步研究與病毒引起的疾病有關(guān)的特定等位基因、評估大熊貓抗病能 力以及更好地設(shè)計(jì)大熊貓保育計(jì)劃，比如選擇適應(yīng)能力強(qiáng)的個(gè)體進(jìn)行野外放歸和選擇優(yōu)良 個(gè)體進(jìn)行人工配種。
【附圖說明】
[0044] 圖1是本發(fā)明對大熊貓I類MHC區(qū)域4個(gè)經(jīng)典座位二號(hào)及三號(hào)外顯子的擴(kuò)增效果 圖；
[0045] 圖2是本發(fā)明對大熊貓Aime-C二號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0046] 圖3是本發(fā)明對大熊貓Aime-C三號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0047] 圖4是本發(fā)明對大熊貓Aime-F二號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0048] 圖5是本發(fā)明對大熊貓Aime-F三號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0049] 圖6是本發(fā)明對大熊貓Aime-I二號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0050] 圖7是本發(fā)明對大熊貓Aime-I三號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0051] 圖8是本發(fā)明對大熊貓Aime-L二號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體；
[0052] 圖9是本發(fā)明對大熊貓Aime-L三號(hào)外顯子基因分型結(jié)果。每個(gè)泳道對應(yīng)不同的 大熊貓個(gè)體。
【具體實(shí)施方式】
[0053] 本發(fā)明的大熊貓I類MHC區(qū)域4個(gè)經(jīng)典座位二號(hào)和三號(hào)外顯子特異引物篩選和基 因分型共三個(gè)步驟：1.以構(gòu)建好的I類MHC基因物理圖譜為基礎(chǔ)，設(shè)計(jì)I類MHC區(qū)域4個(gè) 經(jīng)典座位二號(hào)及三號(hào)外顯子特異引物；2.將合成的引物對I類MHC基因進(jìn)行擴(kuò)增，檢測其 擴(kuò)增準(zhǔn)確性和效率；3.采用步驟2擴(kuò)增產(chǎn)物，用單鏈構(gòu)象多態(tài)性對目標(biāo)片斷進(jìn)行基因分型。
[0054] 下面結(jié)合實(shí)例對發(fā)明作進(jìn)一步說明：
[0055] 1.樣品準(zhǔn)備：大熊貓糞便樣品均來源于臥龍大熊貓研究中心。
[0056] 2. DNA提?。悍勇确路◤募S便中提取DNA。
[0057] 3.引物合成：根據(jù)已經(jīng)測得的大熊貓II類MHC基因組序列，發(fā)現(xiàn)大熊貓Aime-C、 Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號(hào)和三號(hào)外顯子間側(cè)翼序列高度相似，因此設(shè)計(jì)巢式引 物進(jìn)行擴(kuò)增。第一輪引物設(shè)計(jì)在差異較大離外顯子較遠(yuǎn)位置，第二輪引物設(shè)在第一輪引 物內(nèi)但包含完整二號(hào)或三號(hào)外顯子。另外，由于二號(hào)外顯子在基因間相似（三號(hào)外顯子 也類似），所以第二輪引物相同。引物序列：yyE2Bl、yyE2B2，152E2A3、152E2A4，128E22F、 128E22R 及 1300E22F、1300E21R，分別為 Aime-C、Aime-F、Aime-I 及 Aime-L 二號(hào)外顯子巢 式PCR外側(cè)引物；yySE23F、yySE22R為Aime-C二號(hào)外顯子巢式PCR內(nèi)側(cè)引物，而yyE2Bl、 yyE2B2為Aime-F、Aime-I及Aime-L二號(hào)外顯子共同的巢式PCR內(nèi)側(cè)引物。1611H2F、 1R，152E3A1、152E3A2,128E31F、128E32R 及 1300E32F、1300E31R，分別為 Aime-C、Aime-F、 Aime-I及Aime-L三號(hào)外顯子巢式PCR外側(cè)引物；1300E32F、152E3B2為Aime-L二號(hào)外顯子 巢式PCR內(nèi)側(cè)引物，而152E3B1、152E3B2為Aime-F、Aime-I及Aime-C三號(hào)外顯子共同的巢 式PCR內(nèi)側(cè)引物。具體引物序列見序列表。
[0058] 4.引物擴(kuò)增：將上述擴(kuò)增引物分別應(yīng)用于PCR擴(kuò)增所采集的樣品。設(shè)置第一輪PCR 熱循環(huán)退火溫度范圍為59. 5-67. 8°C，第二輪PCR熱循環(huán)退火溫度范圍為61-67. 8°C。
[0059] 5.擴(kuò)增結(jié)果檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物用1. 5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。結(jié)果顯示該引物可有 效擴(kuò)增大熊貓I類MHC區(qū)域4個(gè)經(jīng)典座位二號(hào)和三號(hào)外顯子（如圖1所示）。擴(kuò)增產(chǎn)物大 小在250-350bp之間，條帶單一，可用于大熊貓I類MHC區(qū)域4個(gè)經(jīng)典座位二號(hào)及三號(hào)外顯 子的基因型分析。
[0060] 6.引物擴(kuò)增體系：所述擴(kuò)增大熊貓Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號(hào)及 三號(hào)外顯子的第一輪 PCR 10 μ L PCR 體系是：5 μ L 2x GC Buffer，0· 8 μ L 2. 5mM 的 dNTP， 0. 3yL10mM的第一輪巢式PCR上游引物，0. 3yL 10mM的第一輪巢式PCR下游引物，0. 1 yL 5U/yL的Ex-Taq酶，1 yL基因組DNA，2. 5yL滅菌超純水；第二輪PCR 30yL體系是：3yL 10x Ex-Taq Buffer，2.4yL 2.5mM 的 dNTP，0.9yL 10mM 的第二輪巢式 PCR 上游引物， 0.9yL lOmM的第二輪巢式PCR下游引物，0.3yL 5U/yL的Ex-Taq酶，lyL第一輪PCR產(chǎn) 物，21. 5 μ L滅菌超純水。
[0061] 7.引物擴(kuò)增條件：所述擴(kuò)增大熊貓Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L基因二號(hào) 和三號(hào)外顯子的第一輪PCR擴(kuò)增條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30秒，退火（擴(kuò)增 Aime-C、Aime-F、Aime-I 及 Aime-L 二號(hào)外顯子退火溫度依次為：67. 8°C、65. 3°C、63. 5°C 和62. 5°C ;擴(kuò)增Aime-C、Aime-F、Aime-I及Aime-L三號(hào)外顯子退火溫度依次為：62. 5°C、 59. 5°C、63· 5°C和62. 5°C ) 30秒，72°C延伸60秒（擴(kuò)增Aime-C二號(hào)外顯子延伸30秒），共 22個(gè)循環(huán)，最后72°C延伸5分鐘；第二輪PCR擴(kuò)增條件是：95°C預(yù)變性5分鐘，95°C變性30 秒，退火67. 8°C (擴(kuò)增Aime-C二號(hào)外顯子退火溫度為61 °C ;擴(kuò)增Aime-L三號(hào)外顯子退火 溫度為64°C ) 30秒，72°C延伸30秒，共31個(gè)