流感病毒的GeXP試劑盒在鑒別H5N1、H9N2亞型禽流 感病毒中的應(yīng)用。
[0015] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果：
[0016] 1.本發(fā)明利用GenomeLab (tm)GeXP遺傳分析系統(tǒng)建立了一種能同時(shí)檢測H5、N2、 N1、H9和Μ 5個(gè)基因的禽流感病毒多重逆轉(zhuǎn)錄一聚合酶鏈反應(yīng)（mRT-PCR)方法。首先對(duì)反 應(yīng)條件和多重反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化，然后分別用已驗(yàn)證的陽性模板對(duì)多重PCR體系進(jìn)行特異 性驗(yàn)證。多重檢測體系可以同時(shí)檢測出H5N1和H9N2亞型禽流感病毒，靈敏度為102拷貝/ μ L。該方法具有高通量、特異性強(qiáng)、靈敏度高且快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)H5N1和H9N2亞型禽流感病 毒的流行病學(xué)調(diào)查及其鑒別診斷具有重要意義。
[0017] 2.本發(fā)明建立的GeXP多重PCR技術(shù)能夠同時(shí)對(duì)Η5Ν1和Η9Ν2亞型禽流感病毒的 進(jìn)行檢測和分型，達(dá)到快速鑒別目前對(duì)養(yǎng)禽業(yè)危害最大的H5N1和H9N2禽流感病毒的目的， 對(duì)H5N1和H9N2亞型禽流感的流行病學(xué)調(diào)查及其防控，保障養(yǎng)禽業(yè)的健康持續(xù)發(fā)展具有重 要意義。
【附圖說明】
[0018] 圖1為GeXP多重PCR的毛細(xì)管電泳分析圖；
[0019] 圖2為對(duì)臨床單一感染H9N2亞型禽流感病毒的檢測結(jié)果；
[0020] 圖3為對(duì)臨床單一感染H5N1亞型禽流感病毒的檢測結(jié)果；
[0021] 有關(guān)附圖標(biāo)記的說明：
[0022] 橫坐標(biāo)-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的堿基數(shù)；縱坐標(biāo)-熒光信號(hào)值。
【具體實(shí)施方式】
[0023] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的闡述，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不 局限于實(shí)施例表示的范圍。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明，而非用于限制本發(fā)明的范圍。此 外，在閱讀本發(fā)明的內(nèi)容后，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明作各種修改，這些等價(jià)變化同 樣落于本發(fā)明所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
[0024] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所 使用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。實(shí)施例中所使用的禽流感毒株 及其他禽類病毒參考株均由廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所保存。
[0025] 實(shí)施例1:倉流感病毒多重RT-PCR引物設(shè)計(jì)
[0026] 參考相關(guān)文獻(xiàn)從661^&他數(shù)據(jù)庫中下載禽流感病毒1、!15、!19、附和吧5個(gè)基因的 序列，利用DNAStar分別對(duì)各個(gè)基因核苷酸序列進(jìn)行分析和比較，尋找出適合設(shè)計(jì)特異性 引物的保守區(qū)域，利用GeXP express profiler工具設(shè)計(jì)針對(duì)禽流感病毒5個(gè)基因的特異 性引物（見表 1)，設(shè)計(jì)好的引物米用 Primer Premier 5. 0、NCBI PrimerBlast 和 01igo7.0 進(jìn)行分析和篩選，然后在全部正向引物和反向引物的5'端分別加入一段非同源性獨(dú)特序 列作為通用引物（Uni-Primer)，上游通用引物5'端標(biāo)記焚光染料Cy5,即Cy5-Tag-F，由上 海Invitrogen公司合成，HPLC純化。
[0027] 表1引物信息
[0029] 表1中，兼并堿基代碼R = A/G，D = A/G/T，Y = C/T，下劃線表示的是上、下游通 用引物序列；熒光染料Cy5標(biāo)記上游通用引物標(biāo)簽，下游引物不標(biāo)記。根據(jù)實(shí)際檢測的病 原體的毒株不同以及GeXP系統(tǒng)（如GenomeLabTM GeXP Genetic Analysis System毛細(xì)管 電泳儀）的誤差，使用上述引物對(duì)A-F及GeXP通用引物對(duì)檢測獲得的實(shí)際擴(kuò)增產(chǎn)物長度可 在預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物的長度基礎(chǔ)上上下波動(dòng)3bp。
[0030] 實(shí)施例2 :多重PCR檢測體系的建立
[0031] 2. 1模板及含靶基因的單克隆質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備
[0032] 按照 TaKaRa 公司 MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5. 0(目錄號(hào) DV819A)說明書從提取不同亞型（Η 1-16和N 1-9)禽流感病毒和其他禽類病毒的核酸，獲 得50yL的核酸樣品，分裝置于-80°C保存。RT反應(yīng)體系參照TaKaRa公司逆轉(zhuǎn)錄酶（目錄 編號(hào)D2639A)說明書進(jìn)行，將獲得的RNA樣品分別按照如下反應(yīng)體系和反應(yīng)條件進(jìn)行反轉(zhuǎn) 錄，得到cDNA ;以DEPC水作為總RNA的對(duì)照。
[0033] 反轉(zhuǎn)錄 RT 反應(yīng)液每管 9 μ L :含有 5XReverse Transcriptase Buffer 5 μ L、 50pmol Random Primer (12mer) 1 μ L、lOmM dNTP Mixture 2yL、40U Ribonuclease Inhibitor 0· 5 μ L 和 5U/ μ L AMV Reverse Transcriptase 0.5yL〇
[0034] 反轉(zhuǎn)錄溫度42°C 1.5h，置于-20°C保存。用PCR分別擴(kuò)增含有^!15、!19、附和吧5 個(gè)目的基因區(qū)域的片段，擴(kuò)增后得到的的PCR陽性產(chǎn)物克隆到T-easy載體中構(gòu)建成質(zhì)粒， 經(jīng)測序證實(shí)這5個(gè)重組質(zhì)粒為T-easy載體分別插入了一種上述基因的重組質(zhì)粒，且分別為 上述5對(duì)引物對(duì)A-E的靶基因。
[0035] 2. 2使用單重RT-PCR法驗(yàn)證引物
[0036] 2. 2. 1單重特異性引物（SP-Primer)稀釋至工作濃度1 ymol/L，Cy5-Tag-F和 Tag-R稀釋至工作濃度10 μ mol/L。
[0037] PCR 反應(yīng)液每管 9· 7 μ L :含有 10 X PCR buffer 2· 5 μ L，25mM MgCl2 2· 5 μ L，10mM dNTP Mixture 1 μ L，5對(duì)特異性引物混合物1. 25 μ L，10 μ M/L上、下游通用引物混合物 1. 25 μ L, JumpStart Taq DNA Polymerase L 2 μ L〇
[0038] 反應(yīng)條件為：94￡€511^11，然后941€3〇8,551€3〇8,72 1€3〇8，10個(gè)循環(huán)；941€3〇8， 65°C 30s，10 個(gè)循環(huán)；94°C 30s，53°C 30s，72°C 30s，20 個(gè)循環(huán)；72°C延伸 3min，置于 4°C。
[0039] 2.2.2毛細(xì)管電泳
[0040] 使用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)的各PCR產(chǎn)物同時(shí)進(jìn)行毛細(xì)管電泳檢測，操作 步驟如下：用甲酰胺為上樣緩沖液（美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號(hào)608082)，DNA size standard Kit-400 Base Pairs(美國貝克曼庫爾特公司，目錄編號(hào)608098)與上樣緩沖液 按體積比1: (80-160)徹底混勻，在樣品板上每孔加入39 μ L混勻好的液體，用PCR產(chǎn)物進(jìn) 行10-100倍稀釋，取稀釋后的產(chǎn)物1 μ L加至樣品板，吹打混勾，最后在每孔滴入一滴石蠟 油封閉，以免甲酰胺氧化和樣品蒸發(fā)。在緩沖液板上每孔加入2/3的緩沖液，進(jìn)行毛細(xì)管電 泳。毛細(xì)管電泳的條件如下：毛細(xì)管升溫：溫度50°C ;變性：90°C，120s ;注入樣品：2. 0KV， 30s ;分離：6. 0KV，35min。利用GenomeLab GeXP遺傳分析系統(tǒng)確定各型特異引物擴(kuò)增片段 的實(shí)際檢測大小。
[0041] 2. 2. 3引物對(duì)1-5的單重特異性檢測
[0042] 用引物對(duì)1-5分別擴(kuò)增實(shí)施例1中獲得的cDNA樣品：用引物對(duì)1擴(kuò)增H5N1，引物 對(duì)2擴(kuò)增H5N1，引物對(duì)3擴(kuò)增H5N1，引物對(duì)4擴(kuò)增H9N2，引物對(duì)5擴(kuò)增H9N2。PCR擴(kuò)增和毛 細(xì)管電泳的結(jié)果顯示單重特異性引物只對(duì)靶基因有良好擴(kuò)增且未見有雜峰。
[0043] 不同靶基因片段擴(kuò)增后的大小范圍為：AIV M，210-213bp ;AIV-H5,222-224bp ; AIV-H9,117-119p ;AIV-N1，160-163bp ;AIV-N2,188-191bp。
[0044] 2. 3GeXP多重PCR體系的建立
[0045] 將引物對(duì)1、2、3、4、和5混合成多重混合引物（Mix-Primer)工作液，通過對(duì)引物 濃度的優(yōu)化，使靶基因 M、H5、H9、N1和N2的引物在PCR反應(yīng)體系中對(duì)應(yīng)的的摩爾濃度分別 為 100nmol/L，50nmol/L，100nmol/L，50nmol/L，100nmol/L ;通用引物 Cy5_Tag_F 和 Tag-R 在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度為500nmol/L。其余成分與引物驗(yàn)證的相同。以多株已知病 毒核酸的單一陽性標(biāo)本作為模板或多種病原的混合cDNA樣品作為模板，進(jìn)行多引物PCR反 應(yīng)，反應(yīng)程序及電泳與引物驗(yàn)證的相同。
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