046] 2. 4 結(jié)果
[0047] 5對(duì)引物對(duì)1-5混合后分別對(duì)單一 cDNA或混合cDNA進(jìn)行檢測(cè)。
[0048] 結(jié)果表明多引物單模版分別檢出了 118bp、162bp、188bp、210bp、224bp的擴(kuò)增產(chǎn) 物，陰性對(duì)照無任何擴(kuò)增產(chǎn)物；如圖1所示，多引物多模板結(jié)果表明5個(gè)靶基因可被同時(shí)檢 出，經(jīng)GeXP system多重檢測(cè)體系分析，可檢出與實(shí)際相符的5個(gè)目的峰且無其他雜峰，同 時(shí)可通過產(chǎn)物片段大小來區(qū)分所檢測(cè)的H5N1和H9N2亞型禽流感病毒。結(jié)果也驗(yàn)證了多重 檢測(cè)檢測(cè)體系中的引物特異性。
[0049] 實(shí)施例3 :GeXP system多重檢測(cè)體系特異性檢測(cè)
[0050] 按照MiniBEST Viral RNA/DNA Extraction Kit Ver. 5. 0說明書從尿囊液中分別 提取HA (1-16)和ΝΑ (1-9)亞型禽流感病毒核酸，同時(shí)提取IBV、NDV和ILTV等禽類常見病 毒的核酸分別加入到實(shí)施例2建立的GeXP多重檢測(cè)體系中，檢測(cè)該方法的特異性。多重 PCR完成后，PCR產(chǎn)物上機(jī)進(jìn)行GeXP毛細(xì)管電泳分析，結(jié)果顯示每個(gè)反應(yīng)只出現(xiàn)特異信號(hào)， 無交叉反應(yīng)。HA基因除H5亞型，H9亞型，NA基因除N1和N2亞型外的其他NA亞型，以及 NDV、IBV、ILTV和空白對(duì)照均無反應(yīng)信號(hào)，提示所建立的方法特異性強(qiáng)，與其他檢測(cè)對(duì)象無 交叉反應(yīng)。
[0051] 實(shí)施例4 :GeXP system多重檢測(cè)體系的靈敏度試驗(yàn)和檢測(cè)臨床樣本能力的分析
[0052] 4. 1 GeXP system多重檢測(cè)體系的靈敏度試驗(yàn)
[0053] 用 Promega 公司 RiboMAXTM Large Scale RNA Production System_T7 試劑盒（目 錄號(hào)P1300)按其說明書分別使用Spel和PvuII對(duì)實(shí)時(shí)例2中構(gòu)建的含有M、H5、H9、N1和 N2基因的質(zhì)粒進(jìn)行酶切，將上述5個(gè)含有不同目的基因線性化質(zhì)粒進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成RNA。 利用DU 800UV/Vis分光光度計(jì)對(duì)體外轉(zhuǎn)錄RNA濃度進(jìn)行測(cè)定和定量。根據(jù)核酸濃度和分 子量計(jì)算RNA的拷貝數(shù)。將M、H5、H9、N1和N2基因的體外轉(zhuǎn)錄RNA等比例混合后進(jìn)行10 倍連續(xù)稀釋至1〇6_1〇拷貝/ μ L。以稀釋產(chǎn)物為待檢測(cè)樣品，以實(shí)施例2建立的方法進(jìn)行 GeXP多重檢測(cè)體系靈敏度的檢測(cè)與分析。試驗(yàn)在不同日重復(fù)3次。
[0054] 非同日的3次重復(fù)試驗(yàn)表明，該方法對(duì)于M、H5、H9、N1和N2基因最低可以檢測(cè)至 100拷貝/yL的核酸樣本。
[0055] 4. 2 GeXP system多重檢測(cè)體系檢測(cè)臨床樣本的能力
[0056] 從實(shí)施例1隨機(jī)選擇H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的cDNA，經(jīng)實(shí)施例2中步驟二 的方法進(jìn)行檢測(cè)。
[0057] H9N2亞型禽流感病毒的檢測(cè)結(jié)果如圖2,可以同時(shí)檢測(cè)出118. 1、188. 58和211. 3 三個(gè)目的峰且無其他雜峰，表明樣品中只含有H9N2亞型禽流感病毒的模板，與實(shí)際相符。
[0058] H5N1亞型禽流感病毒的檢測(cè)結(jié)果如圖3,可以同時(shí)檢測(cè)出162.46、210.60和 224. 86三個(gè)目的峰且無其他雜峰，表明樣品中只含有H5N1亞型禽流感病毒的模板，與實(shí)際 相符。
[0059] 前述對(duì)本發(fā)明的具體示例性實(shí)施方案的描述是為了說明和例證的目的。這些描述 并非想將本發(fā)明限定為所公開的精確形式，并且很顯然，根據(jù)上述教導(dǎo)，可以進(jìn)行很多改變 和變化。對(duì)示例性實(shí)施例進(jìn)行選擇和描述的目的在于解釋本發(fā)明的特定原理及其實(shí)際應(yīng) 用，從而使得本領(lǐng)域的技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)并利用本發(fā)明的各種不同的示例性實(shí)施方案以及 各種不同的選擇和改變。本發(fā)明的范圍意在由權(quán)利要求書及其等同形式所限定。
[0060]




【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP引物組，其特征在于：包括5對(duì) 特異性引物，分別是引物對(duì)M-1和M-2、引物對(duì)AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物對(duì)AIV-H9-1和 AIV-H9-2、引物對(duì)AIV-N2-1 和AIV-N2-2、引物對(duì)AIV-N1-1 和AIV-N1-2,其分別具有如SEQ IDNo. 1至SEQIDNo. 10所示的序列。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP引物組，其特 征在于：還包括1對(duì)通用引物，上游通用引物為Cy5-Tag_F，下游通用引物為Tag-R，分別具 有如SEQIDNo. 11至SEQIDNo. 12所示的序列。3. -種同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP試劑盒，包括反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液、 PCR反應(yīng)液、DEPC水和超純水；所述的反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液含有5XReverseTranscriptase Buffer、5OpmolRandomPrimer(12mer)、lOmMdNTPMixture、40URibonuclease Inhibitor和 5U/μLAMVReverseTranscriptase;所述的PCR反應(yīng)液含有 10XPCR buffer、25mMMgCl2、10mMdNTP]\^1加代，5對(duì)特異性引物混合物，1(^]\1/1上、下游通用引 物混合物，JumpStartTaqDNAPolymerase;其特征在于：所述的5對(duì)特異性引物分別是 引物對(duì)M-1和M-2、引物對(duì)AIV-H5-1和AIV-H5-2、引物對(duì)AIV-H9-1和AIV-H9-2、引物對(duì) AIV-N2-1 和AIV-N2-2、引物對(duì)AIV-N1-1 和AIV-N1-2 ;1 對(duì)通用引物分別為Cy5-Tag-F和 Tag-R，其分別具有如SEQIDNo. 1至SEQIDNo. 12所示的序列。4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP試劑盒，其 特征在于：所述的5對(duì)特異性引物中引物對(duì)M-1和M-2、引物對(duì)AIV-H5-1和AIV-H5-2、引 物對(duì)AIV-H9-1 和AIV-H9-2、引物對(duì)AIV-N2-1 和AIV-N2-2、引物對(duì)AIV-N1-1 和AIV-N1-2 在PCR反應(yīng)體系中對(duì)應(yīng)的的摩爾濃度分別為1OOnmo1 /L、50nmo1 /L、1OOnmo1 /L、1OOnmo1 / L、50nmol/L;所述的1對(duì)通用引物Cy5-Tag-F和Tag-R在PCR反應(yīng)體系中的摩爾濃度為 500nmol/L〇5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP試劑盒，其 特征在于：所述的反轉(zhuǎn)錄RT反應(yīng)液每管9μL，含有5XReverseTranscriptaseBuffer 5yL、50pmolRandomPrimer(12mer) 1μL、lOmMdNTPMixture2yL、40URibonuclease Inhibitor0· 5μL和 5U/μLAMVReverseTranscriptase0· 5μL;所述的PCR反應(yīng)液每 管 9· 7μL，含有 10XPCRbuffer2. 5μL，25mMMgCl22. 5μL，lOmMdNTPMixture1μL，5 對(duì) 特異性引物混合物1. 25μL，10μM/L上、下游通用引物混合物1. 25μL，JumpStartTaqDNA Polymerase1. 2μL;所述的DEPC水和超純水各lmL。6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP引物組或權(quán) 利要求2-5任一所述的同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP試劑盒在鑒別H5N1、 H9N2亞型禽流感病毒中的應(yīng)用。
【專利摘要】本發(fā)明屬于禽類病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，本發(fā)明公開了一種同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP引物組、試劑盒及其應(yīng)用。發(fā)明人基于GeXP系統(tǒng)研究設(shè)計(jì)了5對(duì)特異性引物和1對(duì)通用引物，據(jù)此建立了同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的GeXP快速檢測(cè)試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明可同時(shí)鑒別H5N1和H9N2亞型禽流感病毒，靈敏度為102拷貝/μL。本發(fā)明具有高通量、特異性強(qiáng)、靈敏度高且快速等優(yōu)點(diǎn)，對(duì)H5N1和H9N2亞型禽流感病毒的流行病學(xué)調(diào)查及其鑒別診斷具有重要意義。
【IPC分類】C12N15/11, C12Q1/68, C12R1/93, C12Q1/70
【公開號(hào)】CN105316430
【申請(qǐng)?zhí)枴緾N201510843525
【發(fā)明人】謝芝勛, 李孟, 謝志勤, 羅思思, 謝麗基, 黃莉, 鄧顯文, 黃嬌玲, 范晴, 張艷芳, 曾婷婷, 王盛
【申請(qǐng)人】廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所
【公開日】2016年2月10日
【申請(qǐng)日】2015年11月27日