一種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明設(shè)及一種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，該方法通過(guò)增 強(qiáng)自隧提高誘導(dǎo)分化效率。
【背景技術(shù)】
[0002] 神經(jīng)元是一種不可再生的細(xì)胞，因此在人類(lèi)一些損傷神經(jīng)元的疾病中，會(huì)產(chǎn)生一 些不可逆的后果。隨著人類(lèi)壽命的延長(zhǎng)，阿爾茨海默病、腦血管意外等神經(jīng)元受累的疾病增 加，而人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞可誘導(dǎo)分化為有功能的神經(jīng)元，該技術(shù)為治療運(yùn)一類(lèi)疾病提供 了可能性。但是從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元需要繁雜的過(guò)程，如 設(shè)及懸浮培養(yǎng)或者外源細(xì)胞共培養(yǎng)的方法。運(yùn)些方法均有操作繁瑣及耗時(shí)長(zhǎng)等缺點(diǎn)。而 化ury-stewart等使用一些小分子，很好地解決了懸浮及外源細(xì)胞共培養(yǎng)等問(wèn)題。Life公 司也有相關(guān)的試劑盒產(chǎn)品解決了運(yùn)一問(wèn)題。但是從誘導(dǎo)多能干細(xì)胞或者胚胎干細(xì)胞誘導(dǎo)為 神經(jīng)元需要數(shù)周，耗時(shí)長(zhǎng)的問(wèn)題仍未得到很好的解決。因此亟需一種簡(jiǎn)便快捷的方法進(jìn)行 神經(jīng)分化。
[000引 自隧（auto地agy)是一個(gè)吞隧自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞器并使其包被進(jìn)入囊泡，并 與溶酶體融合形成自隧溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過(guò)程，藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝 需要和某些細(xì)胞器的更新。
[0004] 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)（SpinocerebellarAtaxia,SCA)是一組遺傳異質(zhì)性很大的 神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病。ATXN3基因編碼ATAXIN-3蛋白，該基因CAG拷貝數(shù)動(dòng)態(tài)突變時(shí)，其編碼 的蛋白簇基端多聚谷氨酷胺（polyglutamine，化ly曲鏈異常擴(kuò)展W及蛋白質(zhì)的異常聚集， 引起細(xì)胞功能障礙，從而引起神經(jīng)毒性而致病。除了傳統(tǒng)的泛素蛋白酶降解系統(tǒng)，自隧是真 核細(xì)胞中一種高度保守的、通過(guò)溶酶體機(jī)制途徑發(fā)揮作用的降解通路，與神經(jīng)退行性疾病 等疾病密切相關(guān)。研究表明誘導(dǎo)自隧能夠降解聚集突變的ATAXIN-3蛋白，從而防止SCA3/ MJDW及其他神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生。SCA3誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是很好的研究SCA3發(fā)病的工 具。但是自隧在SCA3誘導(dǎo)多能干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元中起到的作用尚需明確。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞 向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法。
[0006] 本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0007] -種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，包括W下步驟：
[000引 （1)融合度70-80%的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS細(xì)胞），加入預(yù)熱的細(xì)胞消化液后 37°C解育5分鐘，接著用移液管吹吸若干次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞分種 在培養(yǎng)孔中；每孔加入ROCK抑制劑后放入37°C、5%C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；
[0009] (2)分種后的第一天，吸棄培養(yǎng)孔的上清液W除去未貼壁的細(xì)胞，加入預(yù)熱的 G化CX)'K神經(jīng)誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；此后隔天換液，分種后第屯天可獲 得PO代的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs)，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天獲得PI代的神經(jīng)干細(xì)胞；
[0010] (3)將聚鳥(niǎo)氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿置于37°C、5%C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 比，接著在培養(yǎng)皿中添加神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將步驟（2)傳代后的P1代的神經(jīng)干細(xì)胞接 種到培養(yǎng)皿中，接種密度為2. 5X104 - 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2;神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要添加雷 帕霉素W促進(jìn)自隧的發(fā)生；培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基，每3 - 4天 更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至12-15天可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞；
[0011] 步驟（1)所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是在無(wú)滋養(yǎng)層條件下培養(yǎng)得到的無(wú)分化或者 僅含少量分化的克??；所述的無(wú)滋養(yǎng)層條件，如使用Essential8?培養(yǎng)基WVitronectin 或Geltrex''作為基質(zhì)；
[0012] 本發(fā)明所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是W人體的皮膚細(xì)胞為材料，利用episomal reprogrammingassay(Invitrogen,USA)重編程試劑盒誘導(dǎo)而成；
[001引步驟（1)所述的細(xì)胞消化液優(yōu)選激emPK)^Aeeatas#細(xì)胞消化液；
[0014] 步驟（1)中的分種密度，優(yōu)選每個(gè)培養(yǎng)孔接種2. 5X105-3. 0X105個(gè)細(xì)胞；
[0015] 所述的ROCK抑制劑優(yōu)選ROCK抑制劑Y27632;
[001引步驟（3)所述的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成與配比如下：
[0017] 1X的Knockout?DMEM/F-12 培養(yǎng)基 97血；
[0018] 2mM的GlutaMAXTM-I添加劑ImL;
[0019] 20ng/mL的bFGF20μL;
[0020] 20ng/mL的EGF20μL;
[00引]2 % 的SiemPro'"'化ural添加劑 2血；
[0022] 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為lOOnmol/L。
[002引步驟（3)所述的神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成與配比如下：
[0024] 1X的Neuroba就1聘抬養(yǎng)基97血；
[002引 2%的B-27?無(wú)血清添加劑2血；
[0026] 2mM的GlutaMAXTM-I添加劑ImL;
[0027] 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為lOnmol/L。
[0028] 自隧存在于ips的誘導(dǎo)分化過(guò)程中，體細(xì)胞具有較多細(xì)胞器，而iPS細(xì)胞器較少， 因此由體細(xì)胞誘導(dǎo)為iPS的過(guò)程中需要自隧參與。自隧是一個(gè)吞隧自身細(xì)胞質(zhì)蛋白或細(xì)胞 器并使其包被進(jìn)入囊泡，并與溶酶體融合形成自隧溶酶體，降解其所包裹的內(nèi)容物的過(guò)程， 藉此實(shí)現(xiàn)細(xì)胞本身的代謝需要和某些細(xì)胞器的更新。而iPS分化為神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元也 具有不同的細(xì)胞器及細(xì)胞結(jié)構(gòu)，自隧在促進(jìn)細(xì)胞器的轉(zhuǎn)換起作用，因此可加快iPS分化為 神經(jīng)干細(xì)胞及神經(jīng)元。
[0029] 本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：
[0030] 1、本發(fā)明方法可加快神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化形成。在正常的iPS細(xì)胞向神經(jīng)元分化過(guò) 程中，添加了雷帕霉素促進(jìn)自隧后可W使細(xì)胞在14天左右即出現(xiàn)神經(jīng)元的形態(tài)。
[0031] 2、本發(fā)明方法改善了脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ξ型iPS的神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)。脊髓小腦共 濟(jì)失調(diào)Ξ型（SCA3)iPS分化為神經(jīng)元后隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，狀態(tài)會(huì)逐漸變差，加入雷帕 霉素后，神經(jīng)元的狀態(tài)比沒(méi)加雷帕霉素的神經(jīng)元狀態(tài)好。
【附圖說(shuō)明】
[003引圖1是分化培養(yǎng)到第14天時(shí)培養(yǎng)基中神經(jīng)元細(xì)胞突起的形態(tài)圖；其中，A-對(duì)比例 (X4) ;B-對(duì)比例（X10) ;C-實(shí)施例（X4) ;D-實(shí)施例（X10)。
[0033] 圖2是SCA3病人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在分化培養(yǎng)過(guò)程中神經(jīng)元細(xì)胞突起的形態(tài)圖； 其中，A-未添加雷帕霉素的（X4) ;B-添加雷帕霉素的（X4)。
【具體實(shí)施方式】
[0034] 下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限 于此。
[00對(duì)實(shí)施例
[0036] -種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，包括W下步驟：
[0037] (1