)無滋養(yǎng)層條件下培養(yǎng)得到的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS)，當(dāng)融合度為70-80% 時(shí)，加入預(yù)熱的S化mPro'K'Accu做e'K'細(xì)胞消化液后37°C解育5分鐘，接著用移液管吹吸 若干次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞分種在培養(yǎng)孔中；分種密度是每個(gè)培養(yǎng)孔 接種2. 5X105 - 3. 0X105個(gè)細(xì)胞；分種時(shí)，可W在培養(yǎng)孔中加入10μΜROCK抑制劑Y27632， W防止細(xì)胞死亡；
[0038] (2)分種后的第一天，吸棄培養(yǎng)孔的上清液W除去未貼壁的細(xì)胞，加入預(yù)熱的 G化eo'K神經(jīng)誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；此后隔天換液，分種后第屯天可獲 得P0代的神經(jīng)干細(xì)胞（NSCs)，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天獲得P1代的神經(jīng)干細(xì)胞；
[0039] (3)將聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿置于37°C、5%C〇2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 比，接著在培養(yǎng)皿中添加神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將步驟（2)傳代后的P1代的神經(jīng)干細(xì)胞接 種到培養(yǎng)皿中，接種密度為2. 5X104 - 5X104個(gè)細(xì)胞/cm2;神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要添加雷 帕霉素W促進(jìn)自隧的發(fā)生；培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基，每3 - 4天 更換一次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至12-15天可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞；
[0040] 步驟（3)所述的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成與配比如下：
[0041] 1X的KnockOutTMDMEM/F-12 培養(yǎng)基 97血；
[0042] 2mM的GlutaMAXTM-I添加劑ImL;
[0043] 20ng/mL的bFGF20μL;
[0044] 20ng/mL的EGF20μL;
[0045] 2 %的S化mPro化ural添加劑2血；
[0046] 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為lOOnmol/L。
[0047] 步驟（3)所述的神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成與配比如下：
[004引 1X的NeurobasaJ"始養(yǎng)基 97血；
[004引 2%的B-27?'無血清添加劑2血；
[0050] 2mM的GlutaMAX?-I添加劑ImL;
[0051] 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為lOnmol/L。
[0052] 對比例
[0053] -種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，在神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基和神 經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基中均不添加雷帕霉素，其他步驟和操作同實(shí)施例。
[0054] 在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用普通倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)基是否出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞突起。結(jié)果 如圖1所示，分化培養(yǎng)到第14天時(shí)培養(yǎng)基中神經(jīng)元細(xì)胞突起的形態(tài)，添加了雷帕霉素的細(xì) 胞更快出現(xiàn)神經(jīng)元形態(tài)?？梢娞砑恿死着撩顾乜杉涌焐窠?jīng)元的分化。
[005引同時(shí)采用SCA3病人皮膚來源的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞（iPS)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，采用實(shí)施例和 對比例的方法，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，采用普通倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)基是否出現(xiàn)神經(jīng)元細(xì)胞突起。 結(jié)果如圖2所示，SCA3病人的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞在分化培養(yǎng)過程中，神經(jīng)元細(xì)胞狀態(tài)較好?？?見，加入雷帕霉素后改善了脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)Ξ型iPS的神經(jīng)元生長狀態(tài)。
[0056] 上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的 限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化， 均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。
【主權(quán)項(xiàng)】
1. 一種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，其特征在于包括以下步驟： (1) 融合度70-80%的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞，加入預(yù)熱的細(xì)胞消化液后37°C孵育5分鐘， 接著用移液管吹吸若干次，使細(xì)胞分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，然后將細(xì)胞分種在培養(yǎng)孔中；每孔 加入ROCK抑制劑后放入37°C、5% C02的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)； (2) 分種后的第一天，吸棄培養(yǎng)孔的上清液以除去未貼壁的細(xì)胞，加入預(yù)熱的Gibe〇KI神經(jīng)誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)；此后隔天換液，分種后第七天可獲得P0代 的神經(jīng)干細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)3-4天獲得P1代的神經(jīng)干細(xì)胞； (3) 將聚鳥氨酸和層粘連蛋白包被的培養(yǎng)皿置于37°C、5% 0)2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)lh，接 著在培養(yǎng)皿中添加神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基，再將步驟（2)傳代后的P1代的神經(jīng)干細(xì)胞接種到培 養(yǎng)皿中，接種密度為2. 5X 104 - 5X 104個(gè)細(xì)胞/cm2;神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中要添加雷帕霉素 以促進(jìn)自噬的發(fā)生；培養(yǎng)2天后，將培養(yǎng)基更換為神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基，每3 - 4天更換一 次培養(yǎng)基，培養(yǎng)至12-15天可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞； 步驟（3)所述的神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基的組成與配比如下： 1 X 的 KnockOut? DMEM/F-12 培養(yǎng)基 97mL ; 2mM 的 GlutaMAX?-I 添加劑 lmL ; 20ng/mL 的 bFGF 20 μ L ; 20ng/mL 的 EGF 20 μ L ; 2%的StemPrc/ Neural 添加劑 2mL ; 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為lOOnmol/L ; 步驟（3)所述的神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基的組成與配比如下： 1X 的 Neurob夠Si?:培養(yǎng)基 97mL ; 2%的：8-27@:無血清添加劑21^; 2mM 的 GlutaMAX?-I 添加劑 lmL ; 再往培養(yǎng)基中加入雷帕霉素至終濃度為l〇nmol/L。2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，其特征在 于：步驟（1)所述的人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞是在無滋養(yǎng)層條件下培養(yǎng)得到的無分化或者僅含少 量分化的克隆。3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，其特征在 于：步驟⑴所述的細(xì)胞消化液為StemPro" Aeeutase?細(xì)胞消化液。4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，其特征在 于：步驟（1)中的分種密度，為每個(gè)培養(yǎng)孔接種2. 5X 105 - 3. 0X 105個(gè)細(xì)胞。5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，其特征在 于：步驟（1)所述的ROCK抑制劑為ROCK抑制劑Y27632。
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種促進(jìn)人誘導(dǎo)多能干細(xì)胞向神經(jīng)元誘導(dǎo)分化的方法，該方法包括以下步驟：將iPS細(xì)胞消化后吹吸分散成單個(gè)細(xì)胞懸液，分種在培養(yǎng)孔中，每孔加入ROCK抑制劑；分種后的第一天，吸棄上清液，加入神經(jīng)誘導(dǎo)完全培養(yǎng)基，培養(yǎng)直至獲得P1代的神經(jīng)干細(xì)胞；將P1代的神經(jīng)干細(xì)胞接種到神經(jīng)元誘導(dǎo)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)基中要添加雷帕霉素以促進(jìn)自噬的發(fā)生；2天后，將培養(yǎng)基更換為添加低濃度的雷帕霉素以促進(jìn)自噬的神經(jīng)元細(xì)胞分化培養(yǎng)基，培養(yǎng)至12-15天可誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞。本發(fā)明方法可加快神經(jīng)元的誘導(dǎo)分化形成，并且改善了脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)三型iPS的神經(jīng)元生長狀態(tài)。
【IPC分類】C12N5/0793, C12N5/0797
【公開號】CN105331583
【申請?zhí)枴緾N201510903506
【發(fā)明人】孫筱放, 歐展輝, 牛曉華, 何文茵, 羅敏, 陳玉嫦
【申請人】廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院
【公開日】2016年2月17日
【申請日】2015年12月8日