一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa及其制備方法和應(yīng)用
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于抗蟲蛋白及生物安全技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種人工合成的Bt抗蟲基 因FLIa及其制備方法和應(yīng)用。
【背景技術(shù)】
[0002] 蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，簡(jiǎn)稱Bt)是一種分布非常廣泛的 革蘭氏陽性菌，屬于原核生物（Procaryotic organism)細(xì)菌綱（Bacteria)芽胞桿菌科 (Bacillaceae)芽胞桿菌屬（Bacillus)。
[0003]Bt在芽孢形成過程中產(chǎn)生一種具有高度特異性殺蟲活性的伴胞結(jié)晶蛋白，稱為 δ-內(nèi)毒素或殺蟲晶體蛋白（insecticidalcrystalprotein，ICP)。在昆蟲幼蟲的中腸道 內(nèi)借助于蛋白酶的水解，原毒素轉(zhuǎn)型為多肽分子，活化了的毒素可以與敏感昆蟲腸上皮細(xì) 胞表面的特異性受體相互作用，誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生一些孔道，擾亂細(xì)胞的滲透平衡，并引起細(xì)胞 腫脹甚至產(chǎn)生裂解，伴隨著上述過程幼蟲將停止進(jìn)食就，最終導(dǎo)致死亡。Bt殺蟲蛋白對(duì)鱗翅 目、雙翅目、鞘翅目、膜翅目等多種昆蟲具有特異性的殺蟲活性。
[0004]Bt殺蟲晶體蛋白分為Cry類蛋白和Crt類蛋白2大類。將具有溶胞作用的Bt殺 蟲蛋白歸到Cyt類，其余歸為Cry類，相應(yīng)的基因記為Cyt和Cry。彼此之間氨基酸同源性 不超過45%的Bt殺蟲蛋白命名為不同的第一分類等級(jí)，采用阿拉伯?dāng)?shù)字書寫，如Cryl和 Cry2 ;氨基酸同源性在45%~78%之間為第二分類等級(jí)，用大寫英文字母表示，如Cry1A和 Cry1B;氨基酸同源性在78%~95%之間為第三分類等級(jí)，用小寫英文字母表示，如CrylAa 和CrylAb;氨基酸同源性大于95%為第四分類等級(jí)，也是最終等級(jí)，用阿拉伯?dāng)?shù)字書寫，如 CrylAal和CrylAa2。目前，已經(jīng)報(bào)道的Bt已增至476種，其中Cry分為58群、449種，Cyt 分為2群、27種。
[0005] 蟲害是造成作物減產(chǎn)、品質(zhì)下降的重要因素之一，我國每年因蟲害造成水稻減產(chǎn) 10 %、小麥減產(chǎn)20 %、玉米減產(chǎn)10 %~50 %及甘蔗減產(chǎn)5 %~20 %，故減少蟲害造成的損失 是增加糧食作物及經(jīng)濟(jì)作物產(chǎn)量及品質(zhì)的重要途徑。但是，很多禾本科作物缺乏抗蟲種質(zhì) 資源，因此，將外源抗蟲基因?qū)牒瘫究谱魑锏难芯烤哂懈卮蟮纳a(chǎn)意義。
[0006] 自從轉(zhuǎn)Bt殺蟲蛋白基因作物問世以來至上個(gè)世紀(jì)末，世界范圍內(nèi)相繼有二十多 個(gè)國家和地區(qū)開始種植轉(zhuǎn)Bt基因的農(nóng)作物。而近10年來隨著轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因農(nóng)作物的不 斷推出和種植面積的持續(xù)上升，除歐洲之外，幾乎全球所有的陸地都種植了轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因 農(nóng)作物。據(jù)統(tǒng)計(jì)2009年全球的轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因農(nóng)作物種植總面積超過了 5億公頃，占全部 轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物種植面積的36%。其中2. 17億公頃種植了只含有Bt殺蟲基因的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作 物，2. 87億公頃種植了轉(zhuǎn)抗除草劑基因和Bt殺蟲基因的農(nóng)作物。美國是轉(zhuǎn)Bt殺蟲基因作 物種植面積最大的國家，其次是印度、阿根廷、巴西和中國。盡管轉(zhuǎn)BtCry殺蟲基因作物對(duì) 環(huán)境的影響在政府和公眾之間存在較大的爭(zhēng)議，但是Bt殺蟲基因農(nóng)作物產(chǎn)生的巨大生態(tài) 效益卻得到了廣泛的認(rèn)可。通過監(jiān)測(cè)農(nóng)藥環(huán)境影響指數(shù)發(fā)現(xiàn)，1996-2008年種植轉(zhuǎn)基因作物 共減少農(nóng)藥使用量35. 5萬噸（占總農(nóng)藥使用量的8. 4% )。僅2008年一年就減少農(nóng)藥使 用量3. 46萬噸（占總農(nóng)藥使用量的9. 6% )，在整個(gè)生態(tài)網(wǎng)絡(luò)中農(nóng)藥環(huán)境影響指數(shù)降低了 18. 2%〇
[0007] 通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，可以將抗蟲基因?qū)胗衩灼贩N中，進(jìn)而提高轉(zhuǎn)基因玉米的抗蟲 性，降低農(nóng)藥的使用量，節(jié)省人力、物力及社會(huì)資源。因此，應(yīng)用新的高抗昆蟲蛋白、提高殺 蟲蛋白的表達(dá)量以及培育新型轉(zhuǎn)基因抗蟲玉米是解決上述問題的最有效途徑之一。美國的 科學(xué)家把Cry基因轉(zhuǎn)入玉米和棉花中，轉(zhuǎn)基因玉米和棉花在美國成功地上市，至今未發(fā)現(xiàn) 它們對(duì)人類有任何負(fù)面影響，這種轉(zhuǎn)基因作物對(duì)于環(huán)境的貢獻(xiàn)是巨大的。在中國，也有許多 科學(xué)家在致力于轉(zhuǎn)Bt基因玉米的研究。中國農(nóng)業(yè)大學(xué)的王國英教授研究的轉(zhuǎn)Bt基因玉米 已經(jīng)在國內(nèi)進(jìn)行了環(huán)境釋放。轉(zhuǎn)Bt基因玉米在中國的商業(yè)推廣將給玉米生產(chǎn)和種植者帶 來極大的收益。中國自2008年國家啟動(dòng)《轉(zhuǎn)基因生物新品種培育科技重大專項(xiàng)》后，在轉(zhuǎn) 基因抗蟲玉米品種培育方面雖有些報(bào)道，但卻沒有能夠最終商業(yè)化，這主要?dú)w結(jié)于Bt基因 的抗蟲效果及轉(zhuǎn)化植株的穩(wěn)定性。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明提供一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa及 其制備方法和應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明為解決技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案如下：
[0010] 本發(fā)明的一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa，該基因的核苷酸序列如序列表中的 SEQIDN0:1 所示。
[0011] 本發(fā)明還提供一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa編碼的蛋白，該蛋白的氨基酸序 列如序列表中的SEQIDN0:2所示。
[0012] 本發(fā)明還提供一種植物表達(dá)載體pTFlOl. 1-ubi-FLIa，該載體含有人工合成的Bt 抗蟲基因FLIa，該載體的核苷酸序列如序列表中的SEQIDN0:3所示。
[0013] 進(jìn)一步的，用EcoRI和HindIII酶切植物表達(dá)載體pCAMBIA3300,回收酶切位點(diǎn) 間的片段ubi-nos，連入植物表達(dá)載體pTFlOl. 1的EcoRI和HindIII位點(diǎn)間，構(gòu)建植物 表達(dá)載體PTF101.Ι-ubi;將人工合成的兩端帶有SmaI和SacI酶切位點(diǎn)的Bt抗蟲基因 FLIa，連入植物表達(dá)載體pTFlOl.Ι-ubi的SmaI和SacI位點(diǎn)間，構(gòu)建抗蟲基因FLIa的植 物表達(dá)載體PTF101.Ι-ubi-FLIa，其核苷酸序列如SEQIDN0:3所示。
[0014] 進(jìn)一步的，該植物表達(dá)載體pTFlOl.Ι-ubi-FLIa包括：P35S啟動(dòng)子、TEV增強(qiáng)子、 bar基因、大豆貯藏蛋白基因vsp終止子、玉米u(yù)bi啟動(dòng)子、FLIa基因和根癌農(nóng)桿菌胭脂堿 合成酶基因nos終止子。
[0015] 本發(fā)明還提供了制備上述人工合成的Bt抗蟲基因FLIa的方法，包括以下步驟：
[0016] 步驟一、將抗蟲基因CrylAb的DomainI和DomainII與抗蟲基因Crylla的 DomainIII進(jìn)行交換融合，獲得重組抗蟲基因MCryll;
[0017] 步驟二、在重組抗蟲基因MCryll的基礎(chǔ)上，在3'端連入抗蟲基因Cryljal的碳末 端，得到重組抗蟲基因FLMCrylla;
[0018] 步驟三、對(duì)重組抗蟲基因FLMCrylla進(jìn)行密碼子改造，獲得Bt抗蟲基因FLIa，其核 苷酸序列如序列表中的SEQIDNO: 1所示。
[0019] 進(jìn)一步的，步驟二中，所述重組抗蟲基因FLMCrylla與Cry基因氨基酸序列最大同 源性為88%。
[0020] 進(jìn)一步的，步驟三中，對(duì)重組抗蟲基因FLMCrylla進(jìn)行密碼子改造包括：基因編碼 框優(yōu)化、消除稀有密碼子而利用最佳化密碼子、二級(jí)結(jié)構(gòu)最小化、調(diào)整GC含量。
[0021] 本發(fā)明提供一種提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性的方法，將上述人工合成的Bt抗蟲基因 FLIa轉(zhuǎn)化植物中，提高轉(zhuǎn)化植物的抗蟲性。
[0022] 本發(fā)明提出一種人工合成的Bt抗蟲基因FLIa在提高轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性中的應(yīng) 用。
[0023] 本發(fā)明的有益效果是：
[0024] 本發(fā)明人工合成的Bt抗蟲基因FLIa可在轉(zhuǎn)化植物中穩(wěn)定遺傳和表達(dá)，且表達(dá)量 高，所得轉(zhuǎn)基因植物抗蟲性好。
[0025] 本發(fā)明人工合成的Bt抗蟲基因FLIa為抗蟲性基因的推廣及商業(yè)化奠定基礎(chǔ)。此 外，該基因轉(zhuǎn)化玉米、棉花、水稻、蔬菜等農(nóng)作物，使其具備相應(yīng)的抗蟲活性，從而降低農(nóng)藥 的使用量，以減少環(huán)境污染和生產(chǎn)成本。
[0026] 本發(fā)明培育出抗蟲植物的方法簡(jiǎn)便而有效，為提高植物抗蟲提供了新的有效選 擇，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和廣闊的應(yīng)用前景。
【附圖說明】
[0027] 圖1為重組抗蟲基因FLMCrylla的獲得過程示意圖。
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